霍乱弧菌实验室检测.pptxVIP

霍乱弧菌的实验室检测;目的:提高检出率,减少漏检以及误判的发生 手段: 检测人员是否有足够的责任心? 检测试剂准备是否齐全且符合要求? 是否严格按照检测流程进行操作? ; 什么是霍乱? 霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（V．cholerae）引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的甲类传染病。 ;病原体 O1群，O139群霍乱弧菌 发病特征： 剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20－50％（重症病人达70－100％） 培养特性： 营养要求不高，兼性厌氧，37℃生长，怕酸嗜碱， pH:7.4-9.6快速生长 检验依据： WS 289-2008 《霍乱诊断标准》 霍乱防治手册（1999年第五版） ; 霍乱的实验室检测 样品的采集和运输 不同样品的病原分离流程及技术要点 ?粪便 ?水体 ?水产品，食品等 平板分离及可疑菌落挑取 菌落鉴定 常用快速检测方法 ?胶体金检测条 ?荧光PCR检测 检测工作中应关注的事项 ; 样品的采集和运输 采集： ?病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品…… ?监测：水样，水产品等 运输： 一般要求在3小时内室温（20-25 ℃ ）条件下送达实验室检测 ? C-B运输培养基（pH8.4）; （或文腊二氏保存液） ? 碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2） ：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。 ;粪便的采集与保存运送 以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取1～3mL，成形便采取指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3～5cm处采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（ＰＨ8.６-9.2），同时划线分离选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板），如不能在６小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基（或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为1∶5。 分离培养要点（两管三板法）： ?挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。 ?第一管碱性蛋白胨水在３７ ℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取0.1～0.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。 ?第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第三板）。 ;水体的采集与保存运送 水体的采集一般用无菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水(深度为 30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25 ℃ ）3小时内送达实验室检测。 分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）： 　 取450ml水样，用1M 氢氧化钠调整至pH 8.4-9.2。然后加10倍浓缩碱性胨水50ml。再加入1%亚碲酸钾0.25～0.5 ml和1000单位/ ml青霉素1 ml。37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）分离培养，同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）。 ;水产品的采集与保存运送 ?通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置 ?涂抹采集： 使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。 ?整体或局部采集： 在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物25克剪碎后，置灭菌均质杯或均质袋中，加入225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外壳等)整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。 分离培养（两管两板法）： 　 接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）．同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于10ml碱