β地中海贫血基因检测pcr反向点杂交法.pptxVIP

β-地中海贫血基因检测 （PCR-反向点杂交法）; β-地中海贫血（简称β-地贫）是一种由于β-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致，是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。在中国人群中常见的突变位点有CD41-42(-TCTT)、CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox-28(A→G)等位点。因本病多为点突变所致，故常用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。;1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握反向点杂交技术原理及方法，熟悉其应用;PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。;【原理】;【原理】;重复循环变性--退火--延伸三过程,每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍,而且这种新DNA分子又可成为下次循环的模板。理论上循环n次，就增加2n倍，即DNA分子数呈指数式增加。当经30次循环后，DNA产量达230拷贝，约为109拷贝。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。;反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。 ;反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交，一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测等多???方面，具有潜在的临床应用价值。;【操作步骤】;PCR扩增条件;3.杂交 ：;4.洗膜 ：;结果判断;41-42N;41-42N;41-42N;广泛应用于基因突变检测（如地中海贫血、G6PD缺乏症、耳聋等遗传病的检测）、基因分型、遗传多态性检测以及病原体检测等多个方面，具有广泛的临床应用价值。;【原理】;反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。 ;【操作步骤】;3.杂交 ：