第三章基因工程工具酶.pptx

;限制性核酸内切酶 连接酶 DNA聚合酶 反转录酶 RNA聚合酶 溶菌酶、蛋白酶K等 ;二、基因工程工具酶的来源;限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）:是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每 条链的一个二磷脂键断裂的内脱氧核糖核苷酸酶． ;1.1 限制性核酸内切酶的命名;1.2 限制性内切酶的种类;1.3 II类限制性内切酶的作用机制;1.4 限制性内切酶的识别序列;找出限制酶的识别序列;识别序列越短，则在DNA序列中出现的几率就越大，识别序列越长，则出现的几率就越小．因???，在基因克隆中要根据不同的要求选择合适的限制酶．;识别序列与出现几率的关系;1.6 多识别序列限制性内切酶;同裂酶：来源不同，但具有相同识别序列的限制酶． 同位酶：具有相同的识别序列，但酶切位点不同的 限制性内切酶． 同尾酶：具有不同识别序列的限制性内切酶，切割 DNA分子后产生相同的粘性末端. 稀切限制性内切酶:由于限制性内切酶识别序列的 特异性，识别位点在DNA分子上出现的几率特 别低．;;1.7 酶切末端; 3’粘性末端：限制性内切酶在二重对称轴的3’端切 割DNA分子的每一条链，使得双链DNA分子交错断开，产生带突出的3’粘性末端的DNA片段．;平末端：限制性内切酶在二重对称轴的上切割 DNA分子的每一条链，使得双链DNA分子断开，产生平末端的DNA片段．;1.8 限制性内切酶反应系统; ; 2）限制性内切酶的用量;4) 酶切反应的缓冲液;1.9 限制性内切酶的Star活性;1.10 DNA分子的片段化;1.11 DNA分子限制性内切酶酶切图谱;酶切片段分析;2) 末端标记DNA的部分酶切法;;3) Bal 31 核酸酶逐步降解法;;2. DNA聚合酶;2.1 DNA聚合酶的种类;2.2 几种DNA聚合酶的应用;切口平移法标记DNA;B）对DNA分子3’突出尾端进行标记 首先用3’?5’外切核酸酶活性去除DNA的3’突出尾而产生3’凹端．然后在高浓度的放射性标记的核苷酸前体的存在下，外切酶降解反应与dNTP掺入3’端的反应达到平衡．该反应实际上是一个不断地从凹端或平端DNA上除去并置换3’端核苷酸的过程．;利用DNA聚合酶I标记DNA的3’端;2）E.coli DNA 聚合酶 I大片段（Klenow片段） A）来源：从蛋白酶从全酶中切除具有5’- 3’外切酶活性的片段，只剩下聚合酶活性及3’-5’外切酶活性，目前作为商品提供的Klenow片段是通过枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I或通过克隆技术获得的单一的多肽链．; B）应用 * 补平限制酶切割产生的3’凹端． * 以[32P]dNTP补平DNA的3’凹端并进行标记． * 对带3’突出端的DNA进行末端标记． * 在cDNA克隆中用于合成cDNA的第二链． * 在体外诱变中用于从单链模板合成双链DNA．;3）T4 DNA 聚合酶 A）补平或标记限制酶消化DNA后产生的3’凹端 B）对3’突出端DNA分子进行末端标记 C）将双链DNA的粘性末端转化为平末端 4）T7 DNA聚合酶 A）用于拷贝长段模板的引物延伸反应 B) 通过补平或交换反应进行末端标记;5） Taq DNA聚合酶 从极度嗜热的栖热水生菌（Thermus aquaticus） 中纯化而得．这些酶具有依赖于聚合作用的5’- 3’的外切酶活性，对核苷酸的插入反应而言， 该酶的具体作用温度取决于靶序列．最佳温度 为75 – 80 ℃，温度为60℃时活性只剩下1/2， 温度为37℃时，活性剩下1/10．但在许多情况 下需要在低于最适反应温度的条件下起始聚合 反应． A）体外扩增特定序列的DNA分子 B）DNA测序：双脱氧核糖核苷酸法;6）反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶） A）种类 目前有两种反转录酶，一种是来源于Moloney 鼠白血病病毒（Mo-MLV）反转录酶基因的表达 产物；另一种是来源于禽成髓细胞瘤病毒 （AMV）反转录酶基因的表达产物．两者间存在 差异如表． 禽源反转录酶 鼠源反转录酶 组成亚基 2 1 最适反应温度 42 oC 〈 42 oC 最适pH值 8.3 7.6 ;B) 应用 将mRNA反转录成双链cDNA而后克隆到原核载体上． 标记带5’突出端的DNA片段． 用于双脱氧链终止法测序