10.5总论第II部-遗传变异的创造-第十章-DNA重组5-转基因植物的筛选和鉴定.pdf

111 （续 第十章 DNA重组 4 ） 2 10-6 转基因植物的筛选和鉴定 转化体的筛选与鉴定是农作物转基因育种中的一个关键性 的问题，贾士荣于1993年提出了一套转基因植物的标准： 3 对于转模式植物应具有： ①应有严格的对照。 ②转化当代(R0)至少有一种相应的酶活分析(如Gus，NPTⅡ)。 ③R1代应有Southern或Northern杂交的证据。 ④有性繁殖作物需要标记基因控制的表现型性状传递给R1代 的证据，无性繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据。 ⑤转化系统应能够重复。 对于转目的基因植物： ①应有严格的对照。 ②应提出转化当代(R0代)目的基因整合和表达的分子生物学 证据(Southern，Northern，Western 或者其它方法)。 ③R 代需有目的基因控制的表型性状(如抗病、抗虫性等)。 0 ④有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性状传递给后代的 证据；无性繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据。 转化体的筛选和鉴定包括转化体的筛选和转化体的鉴定两 个层次。 （一）转化体的筛选 外源目的基因在植物受体细胞中的转化频率往往是相当 低的，在数量庞大的受体细胞群体中，通常只有为数不多 的一小部分获得了外源DNA，而其中目的基因已被整合到核 基因组并实现表达的转化细胞则更加稀少。 因此，为了有效地选择出这些真正的转化细胞，就有必要 使用特异性的选择标记基因(selectable marker genes)进 行标记。 常用选择标记基因包括抗生素抗性基因及除草剂抗性 基因两大类，如卡那霉素抗性基因nptⅡ和潮霉素抗性基因 hpt，除草剂抗性基因bar基因和Glyphosate抗性基因epsps 等。 在实际工作中，将选择标记基因与适当启动子构成嵌 合基因并克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。 当标记基因被导入受体细胞之后，就会使转化细胞具有抵 抗相关抗生素或除草剂的能力，抑制、杀死非转化细胞， 转化细胞则能够存活下来。 由于目的基因和标记基因同时整合进入受体细胞的比率相 当高，因此在具有上述抗性的转化细胞中将有很高比率的 转化细胞同时含有上述两类基因。 （二）转化体的鉴定 通过选择压筛选得到的转基因植株只能初步证明标记基因 已经整合进入受体细胞，至于目的基因是否整合、表达还 一无所知，因此还必须对抗性植株进一步检测。根据检测 水平的不同，转基因植株的鉴定可以分为DNA水平、转录水 平和翻译水平的鉴定。 1. DNA水平的鉴定 DNA水平的鉴定主要是检测外源目的基因是否整合进入 受体基因组，整合的拷贝数以及整合的位置。常用的检 测方法主要有特异性PCR检测和Southern杂交。 特异性PCR反应是利用聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR)技术，在体外对特定目的DNA模板进 行扩增，对扩增产物片段的大小进行检测，以验证是否和 目的基因片段的大小相符，从而判断外源基因是否整合到 转化植株之中。 特异性PCR检测方法具有简单、迅速费用少的优点，但是检 测结果有时不可靠，假阳性率高，因此必须与其它方法配 。 合使用 Southern杂交是依外源目的基因碱基同源性配对的原理进 行的。杂交后能产生杂交印迹或杂交带的转化植株为转基 因植株；未产生杂交印迹的为非转基因植株。 一般是将外源目的基因序列制作成探针与转化植株的总的 DNA进行杂交，它是从DNA水平上对转化体是否整合外源基