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动物基因工程发展历程 1 GENE 古语有云 龙生龙凤生凤，兔子生来会打洞。 老祖先么通过长期生活经验总结出的俗谚 往往与现代科学发现有着惊人的共同点。 现代生物学认为生物的 遗传性状由基因决定 基因遗传信息的基本单位 。一般指位于染色体上 编码一个特定功能产物 ( 如蛋白质或 RNA 分子 等 ) 的一段核苷酸序列。 2 3 1969 年 科学家成功分离出第一个基因 1970 年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶 1972 年美国斯坦福大学 P .Berg 等构建了第一个重组子 1973 年， S.N.Cohen 构建了第一个可以在细胞中表达的重组子 1980 年 科学家首次培育出世界第一个转基因动物转基因小鼠 1983 年 科学家首次培育出世界第一个转基因植物转基因烟草 1988 年 K.Mullis 发明了 PCR 技术加速了基因工程的发展具有里程碑意义 4 动物基因工程 1980 年， Gordon 首次报道用 DNA 显微注射法获得了转基 因小鼠； 1982 年，美国科学 家 Palmiter 首次将大鼠生长激 素基因导入小鼠受精卵的雄性 原核中，获得了转基因小鼠， 其个体比对照鼠增大一倍，称 之为“超级鼠”。转基因动物自 1980 年代诞生以来，一直是 生命科学研究和讨论的热点， 随着研究的不断深入和实验技 术的不断完善，转基因技术得 到了更广泛的应用，几乎每年 都有令人瞩目的研究成果报道， 有些转基因成果已经进入实用 化和商业化的开发阶段。 5 动物基因工程简介 动物转基因主要是将外 源基因转移到胚胎细胞 内的染色体上，并进行 整合、表达和遗传等。 动物转基因技术是一项 高度综合的技术，它涉 及到 DNA 重组技术、 胚胎工程技术和细胞培 养技术等，因而这需要 多学科的交叉和融合。 同时也需要更为严苛的 技术手段。 6 动物基因工程流程 目的基因的分 离与克隆 表达载体的构 建 基因导入 受体细胞的获 得 受体动物选择 转基因胚胎移 植 转基因整合表 达的检测 遗传性能研究 以及性能选育 转基因表达产 物的分离与纯 化 组建转基因动 7 物新类群等 外源基因导入到细胞的方法 物理方法 点击穿孔法 显微注射法 裸露 DNA 直 接注射法 化学方法 DEAE 葡聚糖 法 磷酸钙 DNA 共沉淀法 脂质体载体 包埋法 8 生物学方法 病毒转染法 胚胎干细胞 介导法 精子载体法 这些方法各有自己的特点和优势， 但在整个转基因动物生产过程中， 其基本原理应该是相同。即将 外源 基因或体外重组基因经体外增值和 修饰转移到动物受精卵或细胞内， 或将部分基因剪除或抑制使其在动 物体内得以整合和表达，以产生新 遗传特征或形状的转基因动物。 并 能将新的遗传信息稳定地进行世代 遗传获得新的转基因系或群体。 9 转 基 因 动 物 生 产 基 本 原 理 电击穿孔法 将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能 有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用 , 并且效率较高。活体电 穿孔法的原理很简单 , 在直流电场作用的瞬间 , 细胞膜表面产生疏水或亲 水的微小通道 105 ～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒 , 然后自行恢 复。在此期间生物大分子如 DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。 电穿孔的法的特点： 1 理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官 2 对导入的外源基因片段的大小没有限制 3 电穿孔法操作简单快速 , 电穿孔的时间只有几秒钟 , 而且 DNA 片段不需 要特殊的纯化操作 缺点： 首先 , 外源基因表达持续的时间很短 , 虽然外源基因导入后最快可在 215 小时有表达 , 但大多 1 ～ 2 月后表达量降至很低。外源基因表达的时间主 要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大 差异。 10 电 击 穿 孔 法 流 程 图 11 显微注射法 显微注射法是指在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的 某一部分 ( 如细胞核、细胞质或细胞器 ) 或外源物质 ( 如外源基因、 DNA 片段、信使核糖核酸、蛋白质等 ) 通过玻璃毛细管拉成的 细针，注射到细胞质或细胞核内。是研究各种生物分子的作用、 制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。 显微注射法转入基因长度可以达到数百 kb ，并能随机地整合在 受体细胞染色体 DNA 上，并且直接、相对容易控制应用范围广。 但是有时会导致转基因动物基因组的重排易位、缺失或者定点 突变 12 显 微 注 射 法 流 程 图 13 脂质体载体包埋法 14 脂 质 体 载 体 包 埋 法 流 程 15 病毒转染法 反转录病毒具有侵入宿主细胞并整合 于细胞染色体 DNA 的能力。 将外源基 因 DNA 插入反转录病毒载体，通过辅 助细胞包