哺乳动物总rna提取及电泳.pptxVIP

第四课 哺乳动物总RNA提取及 RNA琼脂糖凝胶电泳 第一部分 哺乳动物总RNA提取 实验原理 异硫氰酸胍可将哺乳动物组织匀浆中蛋白质变性，十二烷基肌氨酸钠可使细胞裂解，并释放RNA，同时保持RAN的完整。苯酚也是蛋白质变性剂，加入氯仿后离心，溶液分为水相和有机相。酸性条件下DNA同蛋白质一起变性被离心下来，绝大部分RNA则保留于水相。水相的RNA可经异丙醇沉淀。 实验试剂 裂解液（4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠 Ph7.0，0.1Mβ-巯基乙醇，0.5%十二烷基肌氨酸钠） 2M醋酸纳，pH4.0 水饱和苯酚，pH5.0 氯仿 75%乙醇（用DEPC处理的去离子水配置） DEPC处理的去离子水 实验步骤 取3克组织，加30ml裂解液，匀浆。 吸取500ul匀浆液于1.5ml微量离心管中. 加50ul2M醋酸纳（pH4.0），500ul水饱和苯酚，100ul氯仿，震荡1分钟。 冰上放置15分钟。 13000rpm，4℃，5分钟。 将上清转移至1.5ml无酶微量离心管中，加等体积的苯酚/氯仿（1:1），震荡1分钟。 13000rpm，4℃，5分钟。 将上清转移至1.5ml无酶微量离心管中，加等体积的氯仿，震荡1分钟。 13000rpm，4℃，5分钟。 将上清转移至1.5ml无酶微量离心管中，加等体积的异丙醇。 0℃放置20分钟。 13000rpm，4℃，10分钟。 去上清。 用1ml75%乙醇洗管壁。 尽量去处乙醇。 室温干燥。 将RNA沉淀溶于10ul经DEPC处理的去离子水中。 -20℃保存。 第二部分 RNA琼脂糖凝胶电泳 实验原理 常用的变性剂甲醛或戊二醛可使蛋白质变性，也可破坏RNA分子的二、三级结构。因此在含有变性剂的琼脂糖凝胶中电泳，可防止RNA被降解，同时可以避免RNA高级结构对电泳结果的影响。 实验试剂 琼脂糖 10X MOPS（吗啉代丙烷磺酸 ）(0.2M MOPS, 50mM NaAc, 10mM EDTA, Ph 7.0) 37%甲醛 RNA上样缓冲液（50%甲酰胺，1X MOPS，6%甲醛，7%甘油，0.3%溴酚蓝） 实验步骤 称取0.5克琼脂糖，加40ml去离子水。 加热将琼脂糖充分融解。 当溶液温度降至60℃左右，加5ml10X MOPS，5ml37%甲醛，2ulGoldView，混匀。 倒入制胶板，室温静置至胶完全凝固。 除去梳齿，将凝胶板放入电泳槽，加入1X MOPS至液面超过凝胶约2mm。 取5ulRNA与10ulRNA上样缓冲液混匀。 65℃10分钟，立即置冰上2分钟。 上样，100V电泳40-50分钟。 在紫外灯下观察电泳结果。 思考题 如何处理玻璃器皿及金属器械，使之无RNA酶？ 如何配制DEPC水？ 如何配制无RNA酶试剂？ 在提取RNA的实验中，你认为操作上应注意那些地方能有助于防止RNA降解？ 在提取RNA的实验中，你认为在哪些环节需要防止RNA酶污染？ 请预习下周实验《反转录合成cDNA第一链 》 实验原理 异硫氰酸胍可将哺乳动物组织匀浆中蛋白质变性，十二烷基肌氨酸钠可使细胞裂解，并释放RNA，同时保持RAN的完整。苯酚也是蛋白质变性剂，加入氯仿后离心，溶液分为水相和有机相。酸性条件下DNA同蛋白质一起变性被离心下来，绝大部分RNA则保留于水相。水相的RNA可经异丙醇沉淀。 实验原理 常用的变性剂甲醛或戊二醛可使蛋白质变性，也可破坏RNA分子的二、三级结构。因此在含有变性剂的琼脂糖凝胶中电泳，可防止RNA被降解，同时可以避免RNA高级结构对电泳结果的影响。 实验步骤 称取0.5克琼脂糖，加40ml去离子水。 加热将琼脂糖充分融解。 当溶液温度降至60℃左右，加5ml10X MOPS，5ml37%甲醛，2ulGoldView，混匀。 倒入制胶板，室温静置至胶完全凝固。 除去梳齿，将凝胶板放入电泳槽，加入1X MOPS至液面超过凝胶约2mm。 取5ulRNA与10ulRNA上样缓冲液混匀。 65℃10分钟，立即置冰上2分钟。 上样，100V电泳40-50分钟。 在紫外灯下观察电泳结果。