IPP 分析免疫组化图片（教学课件）.ppt

2021/4/26 精品 PPT 模板 * 细胞簇的分析 测量整张图片黄色区域IOD。 再测量细胞分布的区域面积 area。 对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N。 以 IOD /（N ）作为统计指标。或IOD/area 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 2.从图片上分析光密度方法 的技术进步 简单测量整张照片的光密度值。 在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。计算其平均值作为整张照片的光密度值。 在照片上准确选择被染上染料的特定颜色的区域，计算这些区域的累积光密度值（IOD），进而计算统计区域的平均光密度值。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪 其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片的整体光密度。 可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 2.2 抽样测量光密度 在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较染色深浅的指标。 随机选取几个区域但是能作到“随机”吗？ 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 2.3 ImagePro plus的独特优势。 准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI (area of interesting ) 。测量这个区域的光密度参数。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 使用IPP比前两种方法更好。 在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的图象分析方法及图象分析程序的。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 3.用IPP分析免疫组化图片的过程 拍摄样品照片。 选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of interesting）。 测量该区域的IOD。 选择并测量有效统计区域的面积 计算光密度平均值IOD/area（ mean density ） 计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间是否有显著性差异。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍摄 与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的显微镜照片有其特殊的拍摄要求。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 显微镜光源 正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色滤光片，灯丝电压为9V左右。一般的显微镜上都会有指示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。 不能通过调整聚光镜光圈的方法减低亮度，这会影响到光学系统分辨率及图象的清晰度。 不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的ND滤光片还行。6%的ND滤光片常导致色彩失真。 如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从而使得测量结果不准确。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 固定显微镜的工作条件 不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上拍摄照片。 为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光源亮度的稳定。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 必须使用手动控制曝光的相机 对每张照片要使用相同曝光时间，而不是由相机自动控制曝光。 染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。 各种拍摄条件确定后，就必须使用这个条件一次拍摄完所有的照片。以保证它们的曝光一致。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 控制相机曝光时间 要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈现纯亮的白色。 拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左右。可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。同时背景灰度值也不宜过高。 把空白灰度值调到230以上相当于在分光光度计上调节100%透射。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 背景的影响 左图：暗且偏蓝的背景严重影响到了阳性区域的色调。而且降低了黄色象素点的IOD值。这会严重影响分析结果。有的CCD具有手动较正色温的功能，可以较正一下背景色调，但暗背景既使不偏色也是影响分析结果的。 2021/4/26 精品 PPT 模板 * 较暗的背景值对分析结果的影响 显著性