基因和T载体的连接实验体会.pptVIP

实 验 体 会 实验常见问题： 基因和T载体的连接 基因片段与载体的酶切 基因片段与载体的连接与转化 跑蛋白胶时常见问题分析 试剂盒的使用 c-di-GMP相关信息 ★基因和T载体的连接 原理：是利用大部分耐热性Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。TA克隆没有方向性。 注意：不要用高保真的酶扩基因，其扩出来的基因不带A；需要在进行加A才能进行T克隆。 正常结果：一般挑5个转化子，至少有3个转化子是阳性。 常见问题： 1、PCR产物和T载体一般连接多长时间？ 分析：一般16 ℃过夜连接（保险）；其实2 h就可以了！（我自己一般就连2 h。） 2、PCR产物和T载体连接过夜后，如果不能接着做转化那可以保存多长时间？ A：放一个星期都没有问题，-20 ℃放半年都没有问题。 3、PCR产物与T载体连不上?？或者挑的转化子全是阴性？ 分析： A：你用的什么DNA聚合酶，高保真DNA聚合酶产物不能用做TA连接的。 B：注意板子上长出来的单菌落总体的数量；如果数量正常即比较多，首先：确保感受态有没有问题；其次：考虑其是否是相同抗性菌的污染，