定量聚合酶链反应qpcr测定技术.pptxVIP

定量聚合酶链反应(Q-PCR)测定技术及其临床应用PCR? PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 … 它最大的特点就是能不断推出新形式。 —— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow]什么是PCR? 我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。……它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis)PCR及有关技术的发展历史（1）1983Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。PCR发明过程的简单回顾PCR及有关技术的发展历史（2）1985关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim)PCR及有关技术的发展历史（3）1987当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准。 成立于1985年底的Perkin-Elmer Cetus仪器公司 （ PECI ） 于这一年的11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪。1989Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的 发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。 Hoffmann-La Roche 公司和Cetus 开 始合作将PCR应用于临床诊断 。PCR及有关技术的发展历史（4）1990 Cetus科学家 D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯 化Taq DNA 多聚酶的方法。 第一个PCR试剂盒用于HLA定量检测分析。 Cetus 科学家H. Erlich 和K. Mullis在德国临床化学领域获得生化分析奖。1991TaqMan 技 术 发 表。 当年11月Hoffmann-La Roche公司从Cetus获得全球 的PCR专利权。 Roche Molecular Systems 创建了单一耐热多聚酶rTth 进行RT-PCR技术，并用于临床RNA病毒检测。 耐热逆转录酶首次由Cetus科学家发现并报道。 PCR及有关技术的发展历史（5）1992当年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利；1993 AMPLICOR HCV*首次用于临床RNA PCR 标 准试剂盒。 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR及有关技术的发展历史（6） 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查PCR 循环 – 第一步 – 加热变性靶序列靶序列PCR 循环- 第二步 – 引物与靶序列退火靶序列3’5’5’3’BiotinPrimer 1Primer 2Biotin3’5’5’3’靶序列PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸靶序列3’5’5’3’BiotinPrimer 1Taq DNAPolymerasePrimer 2Biotin3’5’5’3’靶序列第1个 PCR 循环完成后 – 得到两个拷贝的靶序列靶序列BiotinBiotin 靶序列30次循环后靶序列扩增的数量No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconPCR扩增过程图示PCR扩增的理论模式 PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达： Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n 0≤E≤1 其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。 等式仅在限定的扩增周期