酵母双杂交系统.pptVIP

第十八章 用酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用;蛋白质之间相互作用研究的重要性;研究蛋白质相互作用的常用方法; 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。;一、酵母双杂交系统的建立和基本原理; 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因???录需要反式转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：; 这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。; Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。 两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的1～147位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。 此外，在其N-端还具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768～881位多肽构成。 当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。; Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。 其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。; 当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近, 形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。 Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS，并可与之结合； Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因LacZ的转录。;9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。*** 10、低头要有勇气，抬头要有低气。**** 11、人总是珍惜为得到。***** 12、人乱于心，不宽余请。**** 13、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。***** 14、抱最大的希望，作最大的努力。**** 15、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。***** 16、业余生活要有意义，不要越轨。*** 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。****;酵母转录因子（Gal 4）;（二）酵母双杂交系统的原理;酵母双杂交动画演示（英文）; 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点: 易于转化、便于回收扩增质粒 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相 互结合; 基因组中GAL4基因是缺失型的 基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、 HIS; 表达“诱饵”和“猎物”蛋白； 检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。 做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。;三、酵母双杂交系统的优点;三、酵母双杂交系统的优点; 分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。 用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。 分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。 绘制蛋白质相互作用系统图谱 在药物设计中的应用;利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质 的新功能;　 利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。;利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及 药物对蛋白质之间相互作用的影响　　;利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 （Genome Protein Linkage Map）;五、酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施;假阳性定义 在待研究的两