核酸组织化学.pptxVIP

核酸组织化学 ;核酸： 1.核糖核酸（RNA）：核仁和核糖体 2.脱氧核糖核酸（DNA）：核内的染色质或染色体 ; Feulgen反应 1924年提出,特异性显示DNA分子形态学方法 DNA在酸性环境下水解,断开糖苷键,形成醛基 醛基再与shiff液中的碱性品红特异性结合,形成紫红色醌基; Feulgen反应 应用： 肿瘤细胞具有高增生的DNA含量, 鉴别并协助诊断肿瘤的良恶性 细胞及原代培养细胞DNA分子的检测与鉴定; Feulgen反应 Schiff液的配制 0.05g碱性品红研细，溶于含0.5mL浓HCl的50mL水中，再加入0.5g Na2SO3固体，搅拌后，静置，直到红色褪去 ; Feulgen反应步骤 1. 石蜡切片 2. 切片脱蜡入水 3. 切片用1mol/L HCL冲洗 4. 1mol/L HCL60 ℃温箱水解8 min 5. 室温1mol/L HCL冲洗 ;Feulgen反应步骤 6.蒸馏水洗 7.暗处入Schiff液染色60 min 8.亚硫酸钠溶液洗3次约6 min 9.蒸馏水洗 10.脱水透明、封固。 ;Feulgen反应注意事项 1.不能用含甲醛固定液，可用Carnoy固定液 2.尽量不用冰冻切片，减少非特异染色 3.控制盐酸水解温度和时间 ; 吖啶橙染色 三环芳香类阳离子型碱性荧光染料 嵌入核酸双链的碱基对 与单链核酸的磷酸发生静电相互作用 ; 吖啶橙染色 与DNA结合,525nm,绿色荧光 与RNA结合,650nm,橙红色荧光与单链核酸的磷酸发生静电相互作用 ; 吖啶橙染色 应用： 区分活细胞和死细胞,活细胞核呈黄绿色荧光,死细胞呈红色荧光(溶酶体酶释放所致) 原位区分组织细胞DNA和RNA; 吖啶橙染色 应用： 恶性肿瘤普查: 非典型增生:荧光增强 增生细胞:强荧光 恶性肿瘤细胞:橘红色或火焰;吖啶橙染色步骤 1.95%酒精固定 2.滴加0.01%浓度的吖啶橙荧光染液染色5min 3.PBS漂洗lmin 4.用0.1mol／L氯化钙溶液分色lmin 5.PBS冲洗、封片,荧光显微镜下观察 ;吖啶橙染色注意事项 吖啶橙浓度过高(1:500)或过低(1:105),影响准确性和可信性 甲醛固定的石蜡切片效果不理想 3.PH6.0,DNA结合染料的聚合加速, PH低于3.8,DNA结合染料的聚合抑制 ; DAPI染色 4，6二脒基-2苯吲哚 与DNA特异性结合的荧光染料 可以穿透活细胞胞膜，无明显细胞毒性 与双链DNA结合,荧光强度增强20倍,与单链DNA结合,无荧光增强;DAPI染色步骤 1.培养细胞或组织冰冻切片, PBS漂洗5min 2.DAPI工作液室温染色5-20 min 3.PBS漂洗 4.水溶性封片剂封片,荧光显微镜下观察 ;* 较多单转150Q细胞胞核凋亡，多数共转150Q和GRP78细胞胞核正常;DAPI染色优点 1.荧光稳定性优于Hoechst 2.特异性较EB,PI高; Hoechst33258染色 非嵌入性的荧光染料 与DNA小沟富集AT的区域结合 活细胞或固定细胞 亮蓝色荧光;Hoechst33258染色步骤 1.培养细胞或细胞悬液, PBS漂洗5min 2.Hoechst33258工作液室温染色15min 3.PBS漂洗 4.水溶性封片剂封片,荧光显微镜下观察 ; 碘化丙啶（PI）染色 不能透过完整的细胞膜 正常细胞和凋亡细胞PI拒染 坏死细胞核染红色; PI染色 应用：区分凋亡和坏死细胞AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术： 细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞外侧，AnnexinV和PS具极强的结合力，坏死细胞和凋亡细胞绿色 坏死细胞核被PI染成红色; 双变量FCM的散点图 左下象限显示正常活细胞，为FITC-，PI-； 右上象限为坏死细胞，为FITC+，PI+； 右下象限为凋亡细胞，呈现FITC+／PI- ; Feulgen反应 Schiff液的配制 0.05g碱性品红研细，溶于含0.5mL浓HCl的50mL水中，再加入0.5g Na2SO3固体，搅拌后，静置，直到红色褪去 ;Feulgen反应步骤 6.蒸馏水洗 7.暗处入Schiff液染色60 min 8.亚硫酸钠溶液洗3次约6 min 9.蒸馏水洗 10.脱水透明、封固。 ; 吖啶橙染色 三环芳香类阳离子型碱性荧光染料 嵌入核酸双链的碱基对 与单链核酸的磷酸发生静电相互作用 ;