单核细胞增生李斯特氏菌检验.pptVIP

学习文档 学习文档 单核细胞增生李斯特氏菌的检验 第一法 常规培养法 第二法 全自动酶联荧光 免疫分析仪筛选法 第三法 全自动病原菌检测系统筛选法 学习文档 第一法 常规培养法 检验程序 增菌 分离鉴别培养 生化鉴定及纯培养 5－6d G+; 旋转或翻滚样的运动 动力试验：呈伞状或月牙状生长 生化实验 学习文档 样品： 冷冻样品，2－5℃解冻，不超过18h 若不能及时检验，应置于－15 ℃保存。 非冷冻易腐样品应尽可能及时检验。 若不能及时检验，应置于4 ℃冰箱保存，在24h之内检验。 操作步骤说明 学习文档 两次增菌： 以无菌操作取样品25g（或25mL）加人到含有225mL LB1增菌液的均质袋中，均质后，于30℃±1℃ 培养24h 移取0.1mL，转种于10mLLB2增菌液内，于30℃±l℃ 培养18h～24h。 1. 增菌： 学习文档 2. 鉴别分离培养 划线接种于PALCAM 琼脂平板和科玛嘉李斯特氏菌显色琼脂平板上，于36℃±1℃ 培养24h～48h 。 学习文档 分别接种在木糖－、鼠李糖＋发酵管，于36℃±1℃ 培养24h； 同时在TSA-YE 平板上划线纯化，于30℃±1℃ 培养24h～48h。 选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。 3. 初筛（初步生化实验和纯培养） 学习文档 4 鉴定 4.1 染色镜检： 李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌 http://bacterio.iph.fgov.be/images/listeria-2.jpg/image_large 学习文档 该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动 4.2 典型运动镜检： 从TSA-YE平板挑取生长良好的菌落于洁净载玻片上 用0.85%灭菌生理盐水制成悬浮液 在显微镜下用油镜观察 学习文档 4.2 动力试验： 李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。 4.3 生化鉴定： 挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP 试验：＋ ＋。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1 学习文档 过氧化氢酶： 过氧化氢酶又称接触酶， 能催化过氧化氢分解成水和氧。 菌落－平板－1滴3％的过氧化氢。－－阳性。 学习文档 表1 单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别 菌种 溶血 葡萄糖 麦芽糖 MR-VP 甘露醇 鼠李糖 木糖 七叶苷 单增李斯特氏菌 L.monocytogenes + + + +/+ － + － + 格氏李斯特氏菌 L.grayi － + + +/+ + － － + 斯氏李斯特氏菌 L.seeligeri + + + +/+ － － + + 威氏李斯特氏菌 L.welshimeri － + + +/+ － v + + 伊氏李斯特氏菌 L.ivanovii + + + +/+ － － + + 英诺克李斯特氏菌 L.innocua － + + +/+ － v － + 注：+阳性；－阴性；V反应不定 学习文档 － － － ＋ ＋ 25℃活泼，32 ℃以上不活泼 ＋ β－溶血 ＋ ＋ ＋ ＋ 学习文档 4.4 溶血试验 做法：将羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃ 培养24h～48h，于明亮处观察。 /77/61/01300000332400124641613035175_s.jpg 结果：单核细胞增生李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。 学习文档 4.5 协同溶血试验(cAMP)： 区分单增李斯特菌和伊氏李斯特菌 在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1℃ 培养24h～48h 结果： L.monocytogenes 在靠近金黄色葡萄球菌接种点溶血性增强， 斯氏李斯特氏菌的溶血也增强 伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强 L.mo L.se 金黄 马红 L.iv 学习文档 5 生化鉴定系统 可选择API Listeria 10300生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统等生化鉴定系统对 “3.初筛” 中3个～5个纯培养的可疑菌落进行鉴定 /we