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PCR反应体系组成： (1)引物 与被分离的目的基因两条链的一端序列互补的DNA引物（通常20~30nt) (2)热稳定的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶） (3)四种dNTPs (4)作为模板的DNA序列（即要分离的目的DNA） (5)适当的无机离子 学习文档 聚合酶链反应（PCR）：一种重复性的程序步骤，可导致特异性DNA序列呈几何级数扩增。 学习文档 ? 模板DNA的变性：一般选用95℃左右1min，使 DNA双链解为单链 ? 复性：按引物实际情况确定适当温度，时间一 般30s至1.5min ? 延伸：一般72℃ 1min ? 循环数：按初始模板浓度确定, 一般25－45之间 PCR的主要步骤： 变 性 延 伸 复 性 循 环 PCR 学习文档 * 9 * * * * * * * 学习文档 如上图所示, (a)端粒酶以其RNA为模板, 通过逆转录作用, 催化富含G链的延伸; (b)端粒酶向端粒新3′端移动,继续以其RNA为模板, 催化富含G的DNA母链延长; (c)端粒酶反复移位, 通过逆转录反应使端粒富含G链增长到足够长度; (d)富含C链的空缺部分不需要引物酶合成引物提供3′-OH, 而是富含G的链突出的寡脱氧核苷酸d(GGGGTTTTGGGG)通过非Watson-Crick配对方式自身的GGGG之间按G · G配对, 回折形成发卡并提供3′-OH; (e)由发卡引发富含C链在3′-OH以富含G链为模板, 由DNA聚合酶添加新的dNTP, 进一步延伸填补空缺, 间隙最后由DNA连接酶封口; (f)端粒DNA与端粒蛋白结合, 完成加工后, 形成完整的端粒。 学习文档 学习文档 如上图所示, (a)端粒酶以其RNA为模板, 使用右边的AAC与新掺入的TTG配对, 催化富含G链的延伸; (b) 端粒酶向端粒新3′端移动, 此时模板RNA左边的AAC与3′端新掺入的TTG配对; (c) 端粒酶在模板RNA指导下将6个一组GGGTGG添加到端粒G链3′端, 重复(a) ～(c)反应使端粒富含G链增长; (d) 富含G链充分延伸, 而空缺的富含C链部分由引物酶合成引物RNA, 其序列互补于富含G链3′端; (e) 在新合成引物引发下, DNA聚合酶合成DNA用以填补端粒富含C链的缺口; (f) 引物被切除后, 对应的富含G链突出10～16个核苷酸; (g) 这种带重复序列的端粒DNA与端粒蛋白结合后, 通过G·G配对自身回折在染色体末端形成套索结构(t环, telomere loop)。 学习文档 端粒酶活性与细胞分裂能力的关系 学习文档 归纳： 生物细胞DNA复制分子机制的基本特点 学习文档 五、反转录作用（RNA指导的DNA合成） 定义: 以RNA为模板, 按照RNA中的核苷酸顺序 合成DNA的过程称为反转录(reverse transcription, RT，逆转录)。该过程由反转录酶催化进行。 1970年Temin和Baltimore同时分别从(鸡)劳氏肉 瘤病毒（RSV）和小白鼠白血病病毒（MLV）等 致病RNA病毒中分离出反转录酶，迄今已知的致 癌RNA病毒都含有反转录酶。 学习文档 逆转录病毒基因组的结构 学习文档 + RNA+ DNA- RNA+ DNA- DNA+ 病毒RNA的反转录过程 （以前病毒形式整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化） 单链病毒RNA RNA-DNA杂交分子 双链DNA（前病毒） 反转录酶 反转录酶 逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性： RNA指导的DNA聚合酶活性 DNA指导的DNA聚合酶活性 核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子 中的RNA，可沿5 ′和3′两个方向起核酸内切酶的 作用，产生末端为3′羟基和5 ′磷酸的产物 反转录酶也和DNA聚合酶一样, 沿5′?3 ′方向合成 DNA, 并要求短链RNA作引物。 学习文档 cDNA：利用反转录酶可合成出与任何RNA模板（mRNA，tRNA或rRNA）的碱基序列互补的DNA－－互补DNA（complementary DNA, cDNA）。 几乎所有真核生物mRNA分子的3 末端都有一段polyA, 当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在反转录酶催化下在体外合成与其互补的cDNA，为研究真核结构基因提供了有效途径。 反转录酶发现的理论和实践意义： ①补充和丰富了“中心法则”，不能将其绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。②促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供