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PBMC的分离培养及处理步骤 PBMC的分离培养及处理步骤 PBMC的分离培养及处理步骤 刘凤君实验步骤 1.采血：抽取初治 (初始抗病毒治疗）之前 CHB 、CHC 患者外周静脉血 6ml ，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。 2.稀释：室温下加入等体积的 PBS ，轻轻吹打混匀。 3.加样：取 50ml 离心管，吸取 6ml Ficoll （淋巴细胞分别液）于离心管中，（ Ficoll 与稀释前血液的体积比为 1:1 ），管倾斜 45°，将稀释后的血液在 Ficoll 液面上方约 1cm 处沿管壁迟缓加至 Ficoll 上面。 4.离心： 18-20 ℃,2000rpm ，30min ，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。 5.回收：将移液管直接插入云雾层（或许先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。 6.洗涤：加入起码于 18-20 ℃,2000rpm  PBMC ， 10min  （ 外周血单个核细胞），两次。  体积  3 倍的  PBS  ， 7.细胞计数：弃上清，加 1ml RPMI-1640 培养基 (含 10% 胎牛血清），吹打混匀，制备成 PBMC 细胞悬液。 ①专用仪器测定：吸取一定量的 PBMC 细胞悬液于 EP 管中，取等量 2% 台盼蓝，吹打混匀后吸取 1 滴进行细胞浓度测定。 ②血细胞计数板：取一滴 PBMC 悬液与一滴 2% 台盼蓝染液混匀后 加于血细胞计数板中，在显微镜下计数 4 大格内细胞总数。细胞数 /ml=4 个大方格细胞总数 /4 ×104 ×2（稀释倍数） 8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为 2 ×10 5 /ml 培养基，加于 6 孔板或 24 孔板中进行培养。（我们往常是培养留宿后再进行下一步办理）。 9.扰乱素办理：加入 500IU/ml （培养基的终浓度）的 α -IFN （扰乱素），同时设比较组，时间为 8 小时。（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去扰乱素办理的步骤。 10.细胞收集：将 6 孔板或 24 孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加 200ulTrizol ，用移液枪将孔壁吹打数次后，将 Trizol 转入 EP 管中。 11.细胞冻存：将收集的细胞放入 -80 ℃冰箱中保留。