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第七章 常用分子生物学技术;第 一 节 基因工程 Genetic engineering;目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）;2、限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。;3、基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;二、工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;三、重组DNA技术的基本原理;基本原理;重组DNA技术操作过程可形象归纳为 ; ;第二节 PCR概述;Kary B. Mullis（1944－）;Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…...;Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……;Mullis的第一个PCR实验;PCR的发展史;;PCR不只是一个方法改进;PCR技术与体内DNA复制的区别：;一、PCR的定义;;PCR技术原理;72℃;PCR循环--变性;PCR循环--变性;PCR循环--变性;PCR循环—退火;PCR循环—延伸;PCR循环—延伸;PCR循环—延伸;PCR循环—延伸;PCR整个过程;PCR product;三、PCR的反应体系和方法; 总体积 50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 ;PCR技术的基本过程(1);PCR技术的基本过程(2);;1）PCR反应成分;（2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。;（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误???基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。;（5） Mg2+;2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 ;（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加;经典循环参数（500bp以内）;1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究; ;2)反向PCR (reverse PCR) ;;3）多重PCR（复合PCR）;4）LP-PCR（Labelled primers);;5）ＲＴ－ＰＣＲ;6) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 荧光定量 PCR仪 荧光定量PC