第五章：(酶工程)酶分子修饰.pptxVIP

第五章 酶分子修饰 酶的活性中心 酶化学修饰的目的 酶化学修饰的原理 酶化学修饰的设计 酶化学修饰的种类及应用 ;第一节 酶的活性中心（active site） 一、活性中心的概念 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域. ;;二、活性中心的共性 ;;;;Active site The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.;三、研究酶活性中心的方法 1.物理学方法： 用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。;2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 若某基团被修饰后： 酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团 但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。;; 差别标记： 底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用 去除底物或抑制剂 原来被保护的基团带同位素标记 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。;2)专一性化学修饰（基团专一性修饰） 用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。 3)亲和标记（位点专一性修饰） 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。;化学修饰的专一性;亲和修饰剂： ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。 ②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性 中心的基团形成稳定的共价键。 ;3.蛋白质工程：（定点诱变法） 将酶相应的cDNA定点突变，突变的cDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。;;2. 改变酶特性有两种主要的方法： 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶??活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。; 二、酶化学修饰的目的 （一）研究酶的结构与功能的关系。 （二）人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应 用范围。 ;1. 修饰酶的热稳定性; 2. 修饰酶的抗原性;3. 修饰酶对各类失活因子的抵抗力;4.修饰酶在体内的半衰期;5.最适pH ; 6.Km的变化; 第三节 酶化学修饰的原理 一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。;三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。;四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。; 第四节 酶化学修饰的设计 一、充分认识酶分子的特性 包括酶的—— 1. 活性部位情况 2. 稳定条件及反应最佳条件 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性;二、 修饰剂的选择 要考虑—— 1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量） 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团） 3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件;三、反应条件的选择