酵母杂交技术原理及应用.pptVIP

酵母双杂交系统局限性和存在的问题 　　酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的应用， 但仍存在一些局限性。 　　⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。 另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。 　　⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生假阳性结果。 　　在酵母双杂交的基础上，又发展出了? 酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。 　　酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。 ? 酵母单杂交 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构域可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。 　　据此，我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。 酵母单杂交系统的原理 　　正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2 部分组成： (1) 将文库蛋白片段与GAL4 转录激活域 融合表达的cDNA 文库质粒； 含有目的基因和下游报告基因的报告质粒. 首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株; 再将文库质粒转化入报告株; 若存在文库蛋白与目的基因的相互作用,可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来. 目的基因的分离 目的基因的功能克隆 序列克隆法 筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术 利用差示分析法分离目的基因克隆 DNA插入诱变法分离目的基因 根据生物大分子间的相互作用分离目的cDNA克隆 目的基因的功能克隆 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他蛋白分离技术分离出一定发育时期的特异蛋白 应用蛋白质测序技术测定特异氨基酸序列， 推测编码该蛋白的核苷酸序列，人工合成一段寡核苷酸片段作为探针 从cDNA文库或基因组文库中筛选相应的基因 将分离纯化的特定编码蛋白作为抗原，利用免疫动物制备抗体 用特异的蛋白质抗体筛选含有目的基因插入序列的cDNA表达文库，分离出含有目的基因的克隆。 在平板上涂布文库和制备硝酸纤维滤膜的拷贝 然后将滤膜处理（但不能在80度烘烤），暴露菌落或噬菌斑中的蛋白， 在将滤膜放入含有抗体的溶液中，温育一定时间后，洗去未结合的抗体，在加入第二抗体或葡萄球菌蛋白A。第二抗体是用放射性同位素或生物素或酶标记的，通过该标记找到表达产物能与抗体结合的克隆，从而筛选出目的cDNA克隆。 返 回 　　自然界中有一些蛋白质的核苷酸编码序列，在其进化的过程中保持着高度的保守性，这样就使核酸的种间杂交成为可能。已知组蛋白在因、肌动蛋白基因及β-神经生长因子（β-nerve hrowth factor，NGF）等基因的核苷酸序列，都是有效的同源DNA探针，并已成功地用于分离相关的基因。　　在同一蛋白质家族内，也存在着具有共同氨基酸序列的区段，即所谓的保守区。这些保守区往往是由彼此相邻的6-7个氨基酸组成，这样的长度显然适合于推导合成寡核苷酸探针库，用来分离编码相关蛋白质的cDNA。 序列克隆法 根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因 表达序列标签法分离目的基因ESTs 基因表达序列分析法 返 回 利用差示分析法分离目的基因克隆 mRNA差别显示技术 mRNA差别显示技术 抑制性减法杂交技术 返 回 酵母双杂交 酵母双杂交系统的建立 酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 80年代的工作表明， 转录激活因子在结构上是组件式的，