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蚂蟥冬眠临界温度的研究 蚂蟥Whitmania pigra Whitman又称宽体金线蛭，是2021年版《中国药典》药材水蛭的主要基原动物，具有破血通经，逐瘀消癥的作用，是众多心脑血管中成药的主要原料。蚂蟥是变温动物，当外界环境温度降到一定程度后，蚂蟥会通过逐渐减少自身活动、进食、乃至冬眠，尽可能地降低自身新陈代谢和能量消耗，以利度过寒冷和冬季。虽然近年来蚂蟥人工养殖已取得初步成功，但“冬眠”这一固有生物习性极大程度影响了蚂蟥养殖的规模和效率。目前，对蚂蟥的研究主要集中在呼吸和消化生理、摄食规律及分子生物学等方面，有关蚂蟥冬眠临界温度的研究尚未见诸报道。本研究拟通过研究温度对蚂蟥行为生物学、呼吸生理和消化生理3方面的影响探究蚂蟥冬眠的临界温度，为蚂蟥室内人工养殖和越冬管理提供科学依据。 1 材料 蚂蟥由南京农业大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Wh. pigra。 MR200溶氧测量仪（南京特安科贸有限公司）、*****8L低温保存箱（北京福意电器有限公司），呼吸仪（自制），XHFD内切式匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司），5810R离心机（Eppendorf公司），Alpha1506型紫外可见分光光度计（上海谱元仪器有限公司），FA 1104分析天平（上海精科天平），ZD2型自动电位滴定仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）。 2 方法 2.1 耗氧量、耗氧率的试验设计 试验用蚂蟥暂养7 d，试验前停食2 d，每组随机选取3条10 g左右体格健壮的蚂蟥（重复10次），置于480 mL注水2/3体积的广口玻璃瓶中。试验初始温度为25 ℃，以1 ℃·d-1的速率降温，分别于25，20，15，10，8，6，4，2 ℃稳定1 d后观察记录蚂蟥在各温度下的活动状态，同时进行耗氧量、耗氧率的测定。 2.2 消化酶活力的试验设计 在2.1结果的基础上设计试验，蚂蟥前期处理同2.1。试验初始温度为25 ℃，先以2 ℃· h-1的速率将水温调节至10 ℃，再以1 ℃·d-1的速率降温至4 ℃，分别于10，8，6，4，2 ℃稳定1 d后取样测定。 以上述试验结果为基础，分别于4 ℃稳定10，20，30，40 d后取样测定，以4 ℃稳定1 d 为对照。 2.3 耗氧率的测定方法 参照杭德荣等采用静水法测定，稍加改进，测定总时间为4 h。在水流入呼吸室的过程中，使用溶氧仪在进水口处测定水中的溶氧量标记为DOt1（mg·L-1）；当水充满后密闭呼吸室，准确计时4 h后，测定出水中溶氧量标记为DOt2（mg·L-1）。 2.4 消化酶的测定方法 酶液的制备：每组选取3条健壮蚂蟥（3次重复），固定于冰盘内解剖，取出整个消化道，剔除附着物，用预冷的蒸馏水洗净，吸干组织表面水分，称重，冰浴中进行匀浆，同时加蒸馏水，稀释成含原浆20%的溶液，4 ℃离心15 min（转速为8 000 r·min-1），所得上清液为酶液，置于4 ℃冰箱中低温保存，并于24 h内完成测定。 淀粉酶活力采用3，5二硝基水杨酸比色法测定，在37 ℃条件下，单位体积的酶量1 min水解淀粉生成1 mg还原糖的产量为1个淀粉酶活力单位；脂肪酶活力参照史红专等采用对棕榈酸硝基苯酯（ρNPP）比色法测定，在37 ℃条件下，1 min催化释放1 μmol对硝基酚的酶量定义为1个酶活力单位；蛋白酶活力采用福林酚法测定，每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。组织匀浆液蛋白含量采用考马斯亮蓝G250比色法测定。 2.5 数据分析 试验所得数据先用Microsoft Excel作初步处理，然后采用SPSS 20.0软件包（OneWay ANOVE，LSD）进行分析，P0.05为差异显著。 3 结果与分析 3.1 不同温度下蚂蟥的活动状态 25 ℃时，蚂蟥活动极为活跃，尾部吸盘吸附于容器壁或者全体在水中“波浪式”游动；与25 ℃相比，20，15 ℃时蚂蟥活跃程度都有所下降，15 ℃时可见部分蚂蟥尾部吸盘吸附于容器壁呈“悬挂”静止状态，游动较少；10 ℃时，蚂蟥身体收缩逐渐静止于容器底部，无游动现象；4 ℃后，蚂蟥头部和尾部弯曲，呈现“弯月”状，不食不动伏于瓶底。整个实验过程无蚂蟥死亡。 3.2 不同温度对蚂蟥耗氧量、耗氧率的影响 不同温度对蚂蟥耗氧量、耗氧率的影响结果见图1。随着温度的降低，蚂蟥的耗氧量、耗氧率逐渐下降。降温至4 ℃前，除6 ℃与8 ℃组无显著差异外，各温度组之间均有显著性差异（P0.05），其中10 ℃前耗氧量、耗氧率降低趋势最明显，10 ℃后降低趋势逐渐减缓，4 ℃和2 ℃已无变化。 3.3 不同温度对蚂蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和