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基于芯片介电电泳的细胞特性分析及种类判断 电化学测试技术以其高灵敏度和高集成性在细胞分析中显示出突出的优势，通过细胞电学参数的变化区分细胞及其生物活性具有重要的研究价值和实用意义。陈晓敏等采用阻抗分析仪，在0.01～100 MHz范围内，测量了正常人血液细胞的介电谱，并对正常人血液细胞介电常数进行了相关分析。Cai等在360 pL的微腔体内对心肌单细胞进行实时电流检测，通过在微腔体中布置的两个微电极，实现了单细胞的安培电学在线检测。该课题组还通过微电极测定了单个细胞的电活性，利用电学性质分析了单细胞中离子和代谢物。Huang等通过微流控管道运输和定位单细胞，用烟碱刺激细胞，使其释放多巴胺，并通过安培检测对释放的多巴胺进行了定量分析，通过电学方法实现了细胞的定量分析。Son等设计了一种可以多次使用的安培检测芯片，利用血色素A1c电学特性进行检测分析。Wang等利用介电电泳技术研究了HL-60细胞凋亡早期的介电性质差异。龙泉等通过实时电旋芯片检测分析了JurKat细胞的凋亡，并研究了细胞胞膜性质随细胞凋亡过程的变化。这些研究显示了电学参数在细胞分析方面的重要应用，但其多是通过细胞溶液的介电性质进行分析，对微体系中细胞操纵的问题研究较少，对细胞本身的电学参数方面缺少分析，未能实现细胞相关特性的分析。 本研究利用微流控介电电泳（Dielectrophoresis, DEP）技术实现细胞操纵和控制，利用细胞的不同介电电泳特性，通过临界频率法，提取细胞胞膜电容和膜电导参数，对提取的细胞电学参数在细胞种类及其生物活性方面的意义和应用进行探讨。利用微流控DEP芯片分析方法获得细胞的电学参数，为医疗诊断、食品安全、环境监测、药物/基因筛选，及细胞生物学和神经系统科学等研究提供有用信息。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 ***** IX71显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；*****A交流信号发生器（美国安捷伦科技有限公司）；TGL-16离心机（巩义市英峪予华仪器厂）；senlION5便携式电导仪（美国哈希公司）；KQ-50E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；血球计数板。实验所用试剂均为国产分析纯。 2.2 微流控DEP细胞分析芯片系统 2.2.1 DEP芯片 实验采用DEP芯片测定细胞进行介电电泳时的临界频率，同时用显微镜观察微流控芯片上细胞DEP行为。为了保证细胞的正、负DEP行为得到清晰观察，使细胞DEP性质得到准确判断，采用抛物线电极结构的DEP基片（图1）。选择石英作为金属电极的基片材料，DEP基片上微抛物线电极通过掩膜的制作、 图1 抛物线型DEP芯片 Fig．1 Dielectrophoresis （DEP） microchip with parabolic electrodes薄膜沉积和微图形加工3个典型的MEMS加工步骤获得。盖片采用带有微腔体的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）片，其由聚二甲基硅氧烷通过浇注法制得。将PDMS盖片和抛物线微电极的DEP基片对位键合，构成实验用复合式DEP芯片。在静态停流状态下对细胞的DEP行为进行观察，以确定所选定细胞样本的临界频率。 2.2.2 微流控DEP芯片分析系统 自行搭建了微流控DEP芯片分析系统，用于细胞的参数提取和分析。系统主要由交流信号发生器、倒置显微镜、CCD成像系统、微流控DEP芯片和计算机组成。交流信号发生器施加激发信号，使得微流控DEP芯片上的分析细胞样品产生介电电泳行为，通过显微镜及CCD成像系统观察芯片上的细胞行为，同时采集图像信号（图2）。 2.3 样品处理 将HpeG2肝癌细胞（重庆医科大学附属第二医院提供）悬液以1000 r/min离心5 min，去除上清液；加入缓冲液，再次离心，如此3次，即得实验用HepG2癌细胞。红细胞取自健康人血液2 mL，置于10 mL离心管中，以2000 r/min离心10 min, 去除上清液，加入缓冲液，再次离心，如此3次，即得实验用红细胞。 图2 集成DEP微流控分析系统 Fig．2 Scheme of integrated DEP microchip system吸取2 mL白细胞（重庆医科大学附属第二医院提供）分离液于10 mL离心管，加入2 mL新鲜血液，以2000 r/min离心20 min，用移液管将分层后的白细胞移入装有缓冲液的10 mL离心管中,以2000 r/min离心20 min，即得实验用白细胞。实验用死癌细胞的制备，取部分处理好的活肝癌细胞，在60 ℃中加热5 min即得，用0.1% 台盼蓝染色死肝癌细胞，以便对死、活癌细胞进行显微观测。 缓冲液配制：采用8.5%