植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析.docx

精品学习资料 名师归纳总结 《分子生物学》试验报告 试验一 植物基因组 DNA 的提取及其定性，定量分析 【试验目的】 精品学习资料 名师归纳总结 通过本试验学习利用 CTAB 法从植物组织中提取 DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对 DNA 进行定性定量分析； 【试验原理】 CTAB( 十六烷基三甲基溴化铵 )是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度 下( 大于 0.7 M NaCl) ，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来；利用液氮对植物组织进行研磨，从而破裂细胞；然后加入 CTAB 缓冲液将 DNA 溶解出来，再用酚，氯仿抽提的方法去除蛋白，最终经乙醇沉淀得到 DNA ； 琼脂糖凝胶电泳是分别和纯化 DNA 片段的常用技术； 把 DNA 样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质 (琼脂糖凝胶 )的样品孔中， 并置于静电场上； DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动； DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分 子筛效应；由于糖 -磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此，在肯定的电场强度下， DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型； DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小 的 DNA 分子比分子量大的 DNA 分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分别；凝胶电泳也 可以分别相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子，超螺旋质粒 DNA(cccDNA)泳动最快， 其次为线状 DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒 DNA(ocDNA)； 核酸分子 (DNA 或 RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在 260 nm 波特长有特异的紫外吸取峰， 其吸取强度与核酸的浓度成正比， 这个物理特性为测定核酸溶液浓度供应了基础； 1 OD260 相当于 dsDNA 50 μg/mL， ssDNA 33 μg/mL和 ssRNA 40 μg/mL；可以此来运算 核酸样品的浓度； 紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度， 仍可通过测定 260 nm 和 280 nm 的紫外线吸取值的比值 (A260/A280) 估量核酸的纯度， 如 DNA 的 A260/A280 比值高于 2.0，就可能有 RNA 污染，低于 1.8 就有蛋白质污染； 【仪器，材料与试剂】一，仪器及耗材 离心机，恒温水浴器，台式离心机，电子天平，水平电泳槽，电泳仪，凝胶成像分析系 统，高压灭菌锅，紫外线透射仪，微波炉，紫外分光光度仪，微量移液器 (10，100，1000 μL 量程各一支 )，100 mL 或 250 mL 锥形瓶，量筒，液氮，研磨棒，点样板或 parafilm ，吸头， mL EP 管， PE 手套和乳胶手套；二，药品 精品学习资料 名师归纳总结 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) ， CTAB( 十六烷基三甲基溴化铵 )，β-巯基乙醇，氯仿，苯酚，乙醇，氯化钠 (NaCl) ，盐酸，液氮，硼酸，乙二胺四乙酸 (EDTA) ，溴酚蓝，蔗糖，琼脂糖，核酸染料； 三，试剂 2×CTAB buffer 【1】 【2】 2. 70%乙醇 【3】 RNaseA (天根 ) 【4】 0.5 × TB缓E冲液 (工作浓度 ) 【5】 6× loading buffer 核酸染料 (赛百盛 ) DNA marker DL 2000(Takara) 【6】 8. 酚/ 氯仿 (1:1, V/V) 【试验步骤】 取约 100 mg 新奇的拟南芥嫩叶放入 1.5 mL EP 管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状； 加入 0.6 mL 2 C×TAB 提取液（用前加入 0.2﹪的巯基乙醇） ，混匀，65℃ 水浴 30 min ， 每 10 min 颠倒混匀一次； 取出离心管，冷却后加入 0.6 mL 酚氯仿混合液，混匀； 11,500 rpm 室温离心 8 min( 如没离好可重复一次 )； 将上清液 ( 约 400 μL)转移到另一新的 1.5 mL 离心管中； 加入与上清等体积的氯仿，混匀， 11,500 rpm 离心 8 min ，取上清 (约 350 μL)； 加入 600 μL无水乙醇，上下颠倒混匀， -80℃放置 30 min ； 4℃， 15,800 rpm 离心 20 min ，弃上清； 1 mL 70 ％乙醇 (预冷 )洗涤沉淀 2 次，上下颠倒几次，不能 vortex ，7,000 g 离心 3 min ， 弃上清，风干； 加入 30 μ无L菌水 (含 20 μ g/mL RNase ，A)37℃ 溶解 DNA 30 min ； 取 5 μ L DN样A 品进行琼脂糖凝胶电泳检测： 制备琼脂糖凝胶 称