基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱结合网络药理学探讨杜仲治疗糖尿病肾病的有效成分.docxVIP

基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱结合网络药理学探讨杜仲治疗糖尿病肾病的有效成分 摘要：目的 采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术分析传统中药杜仲水提液中主要化学成分,并结合网络药理学方法预测其中治疗糖尿病肾病(DN)的有效成分,探讨其潜在的作用机制。方法 根据水提液色谱信息和质谱信息,并结合对照品的质谱碎片裂解规律和文献数据,对杜仲水提液化学成分进行鉴定；利用化合物靶点数据库和疾病靶点数据库,预测杜仲活性成分作用的潜在靶点,并筛选出治疗DN的相关靶点；通过String等网络工具,确定核心成分与靶点；将上述关键核心靶点数据导入到DAVID数据库中进行基因本体(GO)和基因功能(KEGG)通路注释分析,分析靶点关联的主要生物代谢通路；最后采用Cytoscape 3.7.0软件构建中药杜仲“活性成分-靶点-DN-通路”网络关系图。结果 通过UPLC-Q-TOF-MS技术共筛选出杜仲水提取液中42个化学成分,其中34个为活性成分,预测出190个潜在的作用靶点；利用网络公共数据平台和网络药理学分析工具检索到224个与DN相关的疾病靶点,筛选出69个核心靶点,3个潜在的核心成分,其中包括桃叶珊瑚苷和咖啡酸；并通过DAVID数据库进行富集分析,找出了治疗DN的10条核心通路,涉及增殖、凋亡、炎症反应、纤维化等生物学过程。结论 本研究初步预测了杜仲水提液中治疗DN的主要有效成分,其作用机制可能与细胞增殖分化、氧化应激、炎症反应、纤维化等方面有关。 糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病主要的慢性并发症之一，是一种较为常见的疾病，也是导致终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）的主要原因杜仲（Eucommia?ulmoides Oliv.）为杜仲科杜仲属植物，其药材是杜仲的干燥树皮，是我国独有的名贵中药材。在传统中医理论中，DN既属“消渴病”范畴，又属“肾病”范畴，故被称为“消渴病肾病”材料与方法Agilent 1290UPLC-6545 accurate mass Q-TOF色谱-质谱联用仪（美国Agilent科技公司）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（3.0 mm×100 mm,1.8μm);MassHunter质谱工作站（美国Agilent科技公司）；超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；Biofuge primoR台式离心机（美国Thermo公司）；Milli-Q超纯水制备仪（美国Millipore公司）；x S105型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；乙腈（质谱纯，德国Merck公司）。松脂醇二葡萄糖苷（批号：111537-201605，纯度为94.6%）和绿原酸（批号：110753-201716，纯度为99.3%）均由中国食品药品检定研究院提供，桃叶珊瑚苷由实验室自制（HPLC分析，纯度99%）。杜仲药材购自湖南省张家界市（茶坤缘公司，湖南省慈利县，林产化工工程湖南省重点实验室科研基地，批号，经中南大学湘雅医院药学部刘韶教授鉴定为杜仲科植物杜仲Eucommia?ulmoides Oliv.的干燥树皮。实验方法色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm,1.8μm）；乙腈（A) 0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱程序：0～10 min,92%～80%A;10～25 min,80%～65%A;25～29 min,65%～5%A；流速：0.4 mL·min质谱条件：离子化方式为电喷雾离子化（ESI），准确质量数用ESI-L Concentration Tuning Mix(G1969-85000）校正，正离子分析模式，MRE扫描方式。扫描检测，m/z 100～1 500，除溶剂气体为氮气，干燥器温度为325℃；干燥器流速6.8 L·min取杜仲树皮，切碎，6倍体积水提取3次，每次提取1.5 h，合并浓缩比重至1.11，加90%乙醇沉淀、离心，取上清液，将上清液用水稀释至比重为1.08，过HP-700大孔树脂（慢速），纯水1.5倍柱体积洗脱，得杜仲水提液。取松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、桃叶珊瑚苷对照品各2.0 mg，精密称定，分别置于10 mL容量瓶中，加适量75%甲醇超声溶解，并用相同溶剂定容至刻度，分别配制成一定浓度的对照品贮备液，进样前将对照品贮备液用75%甲醇稀释10倍，经0.22μm有机孔滤膜滤过。常用的网络拓扑学分析内容包括度、介数、中心节点等，网络分析中关注最多的是度和介数，度指与此节点相互作用的节点的个数，其大小和介数成正比，即依赖此节点的通路