工业淀粉酶的纯化与分析试验报告.pdfVIP

工业淀粉酶的纯化与分析 一． 实验目的 1． 掌握盐析法纯化分离蛋白质的工作原理和方法 2． 掌握利用葡萄糖凝胶层析法进行蛋白质脱盐的技术 3． 掌握测定淀粉酶活力的基本原理和方法 4 ． 学习 Folin- 酚比色法测定蛋白质含量的原理和方法 二． 实验原理 工业淀粉酶含有大量杂质将其溶解浸提后离心， 利用高浓度的硫酸铵溶液将上清液的蛋 白质沉降下来，所得沉淀溶解后即为盐析液。 利用葡糖糖凝胶 G-25 对大分子量蛋白质和小分子盐类的阻滞作用不同，从而经凝胶层 析使盐析液中的蛋白质和盐类分离。 酶活力是以酶在最适条件下， 催化一定化学反应的初速度来表示的。 在本实验中， 是以 一定量的淀粉酶在 37 摄氏度， PH=6.8 的条件下，每分钟水解淀粉酶生成 1mg还原糖的量为 一个酶活力单位，其中还原糖的量用 DNS法测定。 蛋白质在 Folin- 酚试剂的作用下生成钨蓝和钼蓝，测定其在 500nm 波长下的吸光 度 ，从而求得样品中蛋白质的含量。 三． 实验材料及仪器设备 1． 材料：工业淀粉酶 2． 仪器：电子天平；离心机； UV9100型分光光度计 恒温水域；沸水浴 3． 器材：刻度试管： 25ml*21 ；移液管： 1ml*6 、5ml*1 ；烧杯： 250ml*2 、50ml*1; 研钵：一套；移液枪：一套；离心管： 100ml*1;1.5ml*4;7ml*1; 注射器： 1ml*1 ； 层析装置： 1 套；量筒： 100ml*1 ；洗耳球： 2 个；胶头滴管： 2 个；移液管架； 玻璃棒 四． 实验试剂 BaCl 2 溶液（ 1%） 考马斯亮蓝 G-250 1%NaCl 溶液 淀粉溶液（ 0.5%） 磷酸缓冲液（ 0.2molr/L,pH 6.8 ） NaOH 溶液（ 2.5mol/L ） 牛血清蛋白（ BSA）标准液（ 250ug/ml ） Folin- 酚试剂甲 Folin- 酚试剂乙 葡萄糖标准液（ 1mg/ml ） DNS 试剂 五． 实验步骤 1. 浸提 称取 0.317g 淀粉酶制剂， 经浸提离心后转移上清液 1.2ml 于离心管中， 标记为 “粗 酶液”备用。记录剩余体积为 18.2ml 并转移到 50ml 烧杯里，置于冰浴中。 2．盐析 4 2 4 按 70%的饱和浓度称取 6.976g(NH ) SO 固体，研细后，缓缓加入离心后的酶液中。 4 2 4 待(NH ) SO 固体溶解后，冰浴静置 20min 后离心，将离心后固体溶解于 4ml 蒸馏水 中，并分装于 3 支 1.5ml 离心管中，标记“盐析”备用。 3．脱盐 用洗脱液洗脱柱子，经检验没有残留的盐和蛋白质后 , 对蛋白质进行脱盐。用注射器 注射 0.5ml 盐析液， 上样完毕后， 打开出水口， 进行洗脱， 并收集洗脱液， 每管 2ml 。 2 分别用 BaCl 和考马斯亮蓝 G-250 试剂检验试管中洗脱液的成分。把含有蛋白质的收 集液合并于离心管中