[5] 蛋白质工程实验技术原理 II.pdfVIP

第五节 蛋白质工程实验技术原理 II 授课教师：李旭 授课时间：2014年10月17日 蛋白质的表达 蛋白质的表达 • 原核表达系统 • 大肠杆菌表达系统 • 芽孢杆菌表达系统 • 链霉菌基因表达系统 • 真核表达系统 • 酵母表达系统 • 丝状真菌表达系统 • 昆虫表达系统 • 哺乳动物细胞表达系统 • 转基因动植物 • 无细胞表达系统 蛋白质的表达 • 大肠杆菌表达系统 • 分子水平上的遗传背景较为清晰 • 基因工程方法已趋于完善 • 比生长速率高 • 表达系统多样、有效 • 培养基廉价 最佳条件下， E.coli 17分钟扩增一倍 蛋白质的表达 • 大肠杆菌表达系统 – 不利方面： • 内毒素的产生 • 无翻译后修饰及没有有效的分泌系统 • 在葡萄糖代谢中常常产生代谢副产物（乙酸等） – 这些副产物的形成直接影响菌体细胞的生长以及目标产物 的产率，常常在高密度培养过程中遇见 蛋白质的表达 • 大肠杆菌系统表达策略 – 固定菌株，对不同载体及融合蛋白加以筛选 Tag Fusion partner N-terminal His6-tag N-terminal His6-tag thioredoxin N-terminal His6-tag glutathione-S-transferase (GST) N-terminal His6-tag maltose binding protein (MBP) N-terminal His6-tag disulfide oxidoreductase (DsbA) N-terminal His6-tag NusA C-terminal His6-tag 蛋白质的表达 • 大肠杆菌系统表达策略 – 固定载体及融合条件，选择不同生理特点的菌 株 BL21 (DE3) CodonPlus-RIL AGG/AGA (arginine), AUA (isoleucine) and CUA (leucine) BL21 (DE3) CodonPlus-RP AGG/AGA (arginine) and CCC (proline) AGG/AGA (arginine), CGG (arginine), AUA (isoleucine) Rosetta or Rosetta (DE3) CUA (leucine)CCC (proline), and GGA (glycine) AD494 mutation in thioredoxin reductase (trxB) double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and Origami glutathione reductase (gor) for the protein is toxic to the cell, using T7 pLysS or pLysE