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第六章 分子生物学研究方法(下) 本章主要内容 基因表达研究技术 蛋白质组学及研究技术1 基因改造技术（1）体外改造 1）缺失：DNA→限制酶酶切→外切酶Bal 31酶切 →连接酶。 2）点突变：DNA→变性→与突变的引物杂交→聚合反应，连接反应。 定点突变（site-directed mutagenesis） 是指通过PCR等方法向目的DNA片段中引入点突变，使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失等。定点突变能迅速和高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状，是基因工程和蛋白质工程的重要研究手段。 基因的体外改造（2）体内改造 基因敲除：是一种基因打靶技术。主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段；也可通过插入突变,使靶基因失活。1）同源重组2）非同源重组 2 DNA与蛋白质相互作用研究?2.1 凝胶阻滞试验（gel retardation assay） 凝胶阻滞试验，又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay, EMSA ），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。若此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。BAC**放射性标记的DNA细胞蛋白质提取物**蛋白质与DNA结合凝胶电泳BDNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢******放射自显影滞后带表明DNA与蛋白质结合 凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带9、要学生做的事，教职员躬亲共做；要学生学的知识，教职员躬亲共学；要学生守的规则，教职员躬亲共守。10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。11、一个好的教师，是一个懂得心理学和教育学的人。12、要记住，你不仅是教课的教师，也是学生的教育者，生活的导师和道德的引路人。13、He who seize the right moment, is the right man.谁把握机遇，谁就心想事成。14、谁要是自己还没有发展培养和教育好，他就不能发展培养和教育别人。15、一年之计，莫如树谷；十年之计，莫如树木；终身之计，莫如树人。16、提出一个问题往往比解决一个更重要。因为解决问题也许仅是一个数学上或实验上的技能而已，而提出新的问题，却需要有创造性的想像力，而且标志着科学的真正进步。17、儿童是中心，教育的措施便围绕他们而组织起来。2、Our destiny offers not only the cup of despair, but the chalice of opportunity. (Richard Nixon, American President )命运给予我们的不是失望之酒，而是机会之杯。二〇二一年六月十七日2021年6月17日星期四3、Patience is bitter, but its fruit is sweet. (Jean Jacques Rousseau , French thinker)忍耐是痛苦的，但它的果实是甜蜜的。10:516.17.202110:516.17.202110:5110:51:196.17.202110:516.17.20214、All that you do, do with your might; things done by halves are never done right.----R.H. Stoddard, American poet做一切事都应尽力而为，半途而废永远不行6.17.20216.17.202110:5110:5110:51:1910:51:195、You have to believe in yourself. Thats the secret of success. ----Charles Chaplin人必须相信自己，这是成功的秘诀。-Thursday, June 17, 2021June 21Thursday, June 17, 20216/17/2021? 2.2 DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay） 将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链单个末端标记的双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链