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突变体质粒构建-PCR法-2021
突变体质粒构建-PCR法-2021
实验题目：突变体质粒构建——PCR法
蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过PCR方法可向目的DNA片段中引入任何所需的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。PCR定点突变迅速、高效并且重复性好，是基因研究工作中一种非常有用的手段。其基本原理可简述如下图：
8个循环后加入
引物1/引物4
本实验拟在某基因编码区（CDS）内，通过PCR定点突变引入一个EcoRI酶切位点。该基因片段长724bp，上下游分别以XhoI和BamHI两个酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1，即pcDNA3.1-CDS。此基因内部含有一个EcoRI酶切位点，我们通过PCR
变又形成一个EcoRI酶切位点，可以通过EcoRI
单酶切验证突变是否成功。具体设计如下：
仪器、试剂及药品配方：
1. 仪器：PCR仪，电泳槽，水浴锅，凝胶成像仪，离心机，振荡培养箱，温箱，超净工作
台，冰箱 2. 试剂及配方：
2.1 试剂：DNA回收试剂盒，限制性内切酶（BamHI，EcoRI，XhoI），T4连接酶，DNA电
泳marker 2.2 PCR反应体系：
primex 模板
上游引物（5μM） 下游引物（5μM） 水
2.3 primex配制：
10×Taq酶buffer dNTP（2.5μM） 水
2.4 DNA电泳buffer（TAE）：
工作液（1×） 40mM Tris-乙酸
储存液（50×）
242g Tris/57.1ml冰乙酸
12.5μl 1μl 2μl 2μl 7.5μl
0.125μl 2.5μl 2μl 7.875μl
1 mM EDTA
2.5 LB液体培养基（1000ml）
蛋白胨 酵母抽提物 NaCl
2.6 LB固体培养基（100ml）
蛋白胨 酵母抽提物 NaCl 琼脂粉
3. 实验方法：
3.1 PCR制备突变体片段： 3.1.1第一轮PCR反应体系：
100ml 0.5M EDTA（pH8.0）
10g 5g 5g
1g 0.5g 0.5g 1g
94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃
3.1.2 第二轮PCR反应体系：
1min 30S 1min 30S 5min
引物1（5μM） 引物4（5μM） 水
2μl 2μl 补足至25μl
注：引物1/引物4在PCR反应进行8个循环后加入。 反应条件：
94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃
3.2 凝胶回收： a. 配制琼脂糖凝胶； b. DNA琼脂糖凝胶电泳；
c. 紫外灯下截取相应的DNA片段凝胶，置于1.5ml dorf 管内；
d. 每管加入500μl 溶液A，55℃水浴融化10min，其间可振荡助融2-3次； e. 融化后，每管加入15μl 溶液B，混匀，加入离心柱； f. 离心12000rpm，30s；
g. 弃下管液，每管加入500μl 溶液C，离心12000rpm，30s；
h. 重复步骤g（弃下管液，每管加入500μl 溶液C，离心12000rpm，30s） i. 弃下管液，离心12000rpm，30s；
j. 将离心柱置于新的dorf管中，室温敞开离心管盖2-3min，每管加入25μl 溶液D，室温
放置2min；
k. 离心12000rpm，1min。 3.3 酶切体系：
3.3.1构建质粒酶切体系：
1min 30S 1min 30S 5min
35循环（第8个循环后暂停加入引物）
3.3.2酶切验证体系：
3.4 连接体系：
载体（100ng） 片段（68ng） T4连接酶 10×buffer 水
3.5 制备感受态： a.
b. c. d. e. f.
μl μl 0.5μl 1μl 补足至10μl
取培养的菌液1ml转至100ml LB液体培养基，菌体振荡培养至OD600＝0.35（可凭经验）；
将100ml菌液转至两个冰预冷的灭过菌的50ml离心管内，冰浴10ml； 离心，4℃ 4000rpm，10min；
弃上清，每管加入10ml 冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀； 离心，4℃ 4000rpm，10mi
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