第十四章基因重组与基因工程(人卫第七版).pptx

第十四章基因重组与基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering;二、细菌的基因转移与重组;（二）转化作用;（三）转导作用;发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。同源重组不需要特异DNA序列，而是依赖两分子之间序列的相同或类似性。 ;; 内切酶 (RecBCD);Holliday中间体; 由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合,称位点特异重组(site-specific recombination) 。;（二）细菌的特异位点重组;（三）免疫球蛋白基因的重排;由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。;piggyBac转座子的老鼠， 表达红色荧光蛋白;第 二 节 重组DNA技术;克隆羊技术;一、重组DNA技术相关概念 ;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;（二）工具酶 表14-1;（二） 工具酶 ;限制性核酸内切酶的分类;限制性核酸内切酶的作用机制;Bam HⅠ;配伍末端;（三）目的基因;（四）基因载体; 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。; 理想的基因载体应具备下列条件：;1. 质粒 (plasmid);pBR322质粒载体图谱;pUC19质粒载体图谱;2. 噬菌体载体 ; λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;二、重组DNA技术基本原理及操作步骤;图14-10 以质粒为载体的DNA克隆过程;（一）目的基因的获取;（三）外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;2. 平端连接; 选择宿主细胞条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) ; 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等;重组DNA技术操作的主要步骤; 表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化;第三节 重组DNA技术与医学的关系;基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。;思考题;图14-2 接合作用;图14-4 转导作用;λ噬菌体的生活周期;;A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示) ；B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因；C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L;表14-1 重组DNA技术中常用的工具酶; 化学合成法获取目的基因;人DNA;mRNA ;5?;(插入失活法) 抗药性标记选择;组氨酸缺陷 型大肠杆菌; 图14-13 利用α互补原理筛选重组体pUC18;原位杂交;Southern印迹;9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。2月-212月-21Sunday, February 28, 2021 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。17:19:3517:19:3517:192/28/2021 5:19:35 PM 11、越是没有本领的就越加自命不凡。2月-2117:19:3517:19Feb-2128-Feb-21 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。17:19:3517:19:3517:19Sunday, February 28, 2021 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。2月-212月-2117:19:3517:19:35February 28, 2021 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。28 二月 20215:19:35 下午17:19:352月-21