Vigene稳转株构建流程.pdfVIP

Vigene 稳转株构建流程 稳转株即稳定表达细胞株， 指的是基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰 某特定基因的细胞系。慢病毒感染 -药物筛选法是目前广泛应用的稳转株构建方 法，具有高效整合、目标细胞广泛等特点。 一．准备及预实验 1. 确定细胞系相关信息，需包括如下内容 目标细胞系培养条件 目标细胞增殖速度 支原体污染情况 注：为避免慢病毒感染后细胞死亡，务必保证细胞无支原体污染！ 2. 预实验确定 MOI 值 （1） 查阅文献确定慢病毒在目标细胞系中的 MOI； （2） 参考查阅得到的数据，设计梯度实验，摸索最适 MOI。 3. 预实验确定筛选药物用量： （1） 查阅 Puromycin/Blastincidin 等在目标细胞系中稳转株筛选的致死用量 信息； （2） 参考查阅得到的数据，确定 3 个药物浓度梯度（如没有相关信息，则 需将药物浓度梯度范围增大，数量增多至 6 个）； （3） Day0将细胞铺于 6 孔板中，使 Day1 细胞融合度约 90%； （4） Day1按（ 2）中设置的药物梯度，加入药物； （5） Day4换液，并重新加入药物； （6） Day7观察，找到致死率 100%的孔，该孔使用的药物浓度， 即为药物筛 选浓度。 附 1：经验筛选药物用量 二．稳转株筛选及构建 注：以下实验参数，按 1 株稳转株为例描述，实验需考虑有无对照稳转株！ 4. 细胞铺板： 将细胞接种于 6 孔板中（ 4 个孔），使次日细胞融合度约 70% 5. 病毒感染： 根据预实验确定的 MOI 值，计算慢病毒体积，添加慢病毒（每孔添加 ADV- HR 2μL）； 6. 换液： 慢病毒感染次日，将细胞进行换液处理； 7. 观察感染效率： 感染后 72 小时，观察感染效率，效率最低不应低于 40%。 8. 筛选： （1） 多克隆稳转株：从感染 72 小时后开始于 6 孔板中加筛选药物，每隔 2 天， 重新换液加入药物。药物筛选需至少持续 14 天，直至显微镜下观察荧光 细胞比例为 100%。 注：第一次加入药物时在上午进行， 4-6 小时后观察细胞状态， 如细胞 死亡过多，需更换新鲜不含药物的培养基。 附 2 ：多克隆稳转株 多克隆稳转株的荧光通常强弱夹杂。 （2） 单克隆稳转株：建立在获得多克隆稳转株基础上 A． 有限稀释法： a. 取 24 个 1.5 毫升 EP管，每管中加入 800 微升完全培养基； 用胰酶将多克隆稳转株消化 （90%融合度，10 毫升培养基终止消化） ， 取 80 微升至第一个 EP管中，混合均匀； 注：应使用 1000 微升枪尖， 混合时不要过度吸打， 以免破坏细胞。 b. 从第一个 EP管中取 80 微升至第二个 EP管中，混合均匀，以此 类推。 c. 将 EP管中的细胞悬液，以每孔 100 微升，接种于 96 孔板中； d. 过夜培养后，观察第 12-24 列，寻找只含有 1 个细胞的孔，并做 好标记； e. 培养 3-4 周，待标记孔中细胞扩增后，消化传代扩增，即为单克 隆稳转株细胞。 注：培养的第一周不要换液，接下来每 3-4 天换液。 B． 平板挑取法