基于illuminamiseq高通量测序技术的紫萍内生细菌群落特征研究.docxVIP

基于illuminamiseq高通量测序技术的紫萍内生细菌群落特征研究 摘要：【目的】研究紫萍内生细菌群落特征，为揭示其生态功能提供全面的遗传信息。【方法】以宿州市新汴河中的紫萍为研究对象，采用Illumina MiSeq高通量测序技术测定紫萍内生细菌16S rDNA的V5～V7变异区序列，使用FLASH、UCHIME和UPARSE等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元（OTUs）数量。【结果】紫萍内生细菌主要包括4大类群，最优势类群为变形菌门，其中包括β–变形菌纲、α–变形菌纲、γ–变形菌纲和δ–变形菌纲；其次为拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门。主要菌属包括污泥单胞菌属、黄杆菌属、红长命菌属、氢噬菌属、水库杆菌属、根瘤菌属、艾德昂菌属、嗜甲基菌属、红细菌属、生丝微菌属、食酸菌属、甲基娇养杆菌属、芽单胞菌属、不粘柄菌属、纤维弧菌属、鞘氨醇单胞菌属等，这些菌属与水体中氮、碳、磷等生物地球化学循环关系密切。【结论】紫萍内生细菌对增强浮叶植物净化水体能力和维持淡水生态平衡发挥重要作用，其群落特征将为选育具有增强植物修复潜力的功能菌株提供有效工具。 水生植物作为一个功能群，在淡水生态系统中占有独特的生态位，不仅能够通过植物吸收、植物固定和植物提取等机制来直接转化与降解污染物，而且其根系的代谢活动可为各种微生物提供适宜生境紫萍（Spirodela polyrrhiza）属于被子植物门（Magnoliophyta）、单子叶植物纲（Liliopsida）、天南星目（Arales）、浮萍科（Lemnaceae），是一类植株较小的漂浮被子植物，也是世界上最小、生长速度最快、形态最简单的开花植物高通量测序技术（High-throughput sequencing）的使用为揭示自然界微生物的多样性提供了便利，使研究者能更全面、更精确的测定生境中各类微生物的相对丰度。本项目旨在通过高通量测序技术揭示新汴河水域中紫萍的内生细菌群落结构，进行微生物群落多样性分析及功能预测。1 材料与方法1.1 样品采集从朱仙庄煤矿区的新汴河中采集紫萍。将采集的紫萍种质带回实验室，用蒸馏水冲洗干净后，挑选叶状体与不定根完整的紫萍，于霍格兰氏营养液中培养14 d。1.2 样品消毒取250 mg鲜重紫萍，在无菌条件下，70%乙醇表面消毒15 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞浸泡5 min，无菌水冲洗5次，然后用无菌滤纸吸干水分。同时，取100μL最后一次冲洗的无菌水涂布于LB、869、284、NB、R2A平板1.3 总DNA提取紫萍以及体内的内生细菌的总DNA，采用改进的CTAB法进行提取。将表面消毒完善的样品置于液氮中速冻，用预冷过的无菌研钵研磨成细粉末。再将粉末状材料转移至2 m L Eppendorf管内，立即加入1.2 m L经65°C预热的CTAB extraction buffer重悬粉末，65°C水浴1 h，每15 min温和地上下翻转混合4～6次。取上清液，加等体积苯酚/氯仿/异戊醇与氯仿/异戊醇各抽提一次。再加入800μL预冷异丙醇于-20°C沉淀10 min。12 000 rpm离心10 min，用250μLTE buffer重悬，同时加入2.5μL RNase于37°C孵育30 min。加25μL 3M Na Ac及600μL预冷无水乙醇于-20°C沉淀30 min。70%乙醇漂洗沉淀。沉淀干燥后，溶于35μL TE buffer，-20°C保存样品。1.4 PCR扩增采用巢式引物799F (5-AACMGGATTAG-ATACCCKG-3）和1392R (5-ACGGGCGGTGTG-TRC-3),799F (5-AACMGGATTAGATACCCKG-3）和1193R (5-ACGTCATCCCCACCTTCC-3）扩增微生物16S r DNA的V5～V7高变区1.5 文库构建使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建库，采用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。1.6 生物信息学分析首先利用Trimmomatic软件2 结果与分析2.1 形态学鉴定早期的分类系统2.2 α-多样性分析随着测序数量的增加，稀释曲线（图2A）、Shannon指数曲线（图2B）以及Chao1指数曲线（图2C）逐渐趋于平缓，说明测序数据足够大，实验取样基本合理，置信度较好，基本能够体现真实环境中紫萍内生细菌群落结构特征。2.3 群落特征解析在门分类水平，紫萍内生细菌主要分布于4个菌门（图3A），分别是酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroide