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分子生物学试验设计报告-四川大学 分子生物学试验设计报告-四川大学 PAGE / NUMPAGES 分子生物学试验设计报告-四川大学 分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 绿色荧光蛋白的克隆表达 实验名称 实验所属学科 分子生物学实验 实验展开 四川大学江安校区生物实验室 支撑平台 项目构成员基本信息 序号 1 2 姓名 /性别 易尧 王远璋 学号 专业年级 2013 级 2013 级 所在学院 生命科学学院 生命科学学院 一、前言 荧光蛋白是大海生物体内的一类发光蛋白，  分为绿色荧光蛋白、  蓝色荧光蛋白、 黄色荧 光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于 1962 年从多管水母中发现并分别获取的一种发光 蛋白。它是由 238 个氨基酸构成的“ β -桶”型三维立体构造，其中 65 至 67 位氨基酸（丝 氨酸 -酪氨酸 -甘氨酸）形成发光团，为主要的发光地点。 经过生物化学的方法将基因做小小的改变， 就能够改变 GFP 中的氨基酸，获取变异 GFP。 当前应用许多的 GFP 的突变体 -加强型绿色荧光蛋白（简称 EGFP） 传统的 PCR 产物克隆方法主要有两种：一种是 PCR 引物设计时引入载体上的酶切位 点， PCR 产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是 TA 载体连结。这两种方法费 时费劲，过程繁冗。 而本实验采纳的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简短的克隆方法，旨在战胜 上述缺点， 它能够在质粒的任何位点进行一个或多个目标 DNA 的片断的插入， 而不需要任 何限制性内切酶和连结酶。打破传统的双酶切再加上连结，只要要一步重组法，即可获取 高效率克隆的重组载体 ，这个重组载体能够在必定的宿主细胞中进行扩增， 形成大批的子代 分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。经过质粒重组形成所需要的重 组质粒 pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，经过酶切、 PCR 及用 IPTG 引诱检测 能否在大肠杆菌体内引诱表达成功。 菌液 PCR 是直接用菌液作为模板进行 PCR 的一种选用成功导入载体的菌落的方法， 省时，快捷，但简单出现假阳性。为了防止这类状况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改良菌液办理方法。 二、实验流程 扩大培育大肠杆菌 ↓ 碱法提质粒 ↓ 电泳检测与提纯所获取的质粒 ↓ ↓ PCR 扩增 EGFP 和 PET-28a（适应于无缝克隆的特别 引物） ↓ 使用无缝克隆试剂盒或改良方法进行重组质粒的构 建 ↓ pET-28a-GFP 重组质粒转变到 DH5 α ↓ 使用菌液 PCR 挑选、检测成功导入载体的菌落 ↓ 扩增挑选出的菌落并提取质粒（胶回收） ↓ pET-28a-GFP 重组质粒转变到表达菌 BL — 21 ↓ 重组绿色荧光蛋白（ GFP）的引诱表达 三、实验步骤 1.质粒 DNA 的提取 1.1 实验原理： 1.1.1. 质粒：一种染色体外的遗传因子， 大小在 1kb~200kb 之间， 是拥有双链闭合环 状构造的 DNA 分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒拥有自主复制能 力，，经常编码一些对宿主有益的酶的基因，包含抗生素、修饰酶等。 1.1.2. 载体：要把一个实用的外源基因经过基因工程手段，  转变到细胞中去进行生殖 和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这类工具就叫载体。当前除 了大肠杆菌中的质粒、 λ 噬菌体、 M13 噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。 1.1.3. 碱变性法抽提质粒 DNA ：基来源理是依据染色体 DNA 和质粒 DNA 分子量的 巨大差别而达到分别的。在实验时，我们先 分别细胞，经过螯合金属离子使酶失活， 并防备 DNA的降解。随后细胞在 NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体 DNA发 生变性，在酸性条件下质粒 DNA复性，同时留在上清液中。而大肠杆菌 DNA和蛋白 质 -SDS 复合物等发生积淀。由此达到分别的成效 1.2 实验目的： 掌握碱法抽提质粒 DNA 的原理和方法。 1.3 实验资料： 1.3.1 资料：含  pET- 28a  质粒的大肠杆菌，含  pEGFP-N3  质粒的大肠杆菌 1.3.2 试剂： 1）溶液Ⅰ 50 mL, 葡萄糖 , 50 mmol/L , 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) , 用前加溶菌酶 4mg/L.121 ℃高压灭菌 15 min 后置于 0~4 ℃储存； 2）溶液Ⅱ 100 mL, 0.2 mol/L NaOH ,SDS, 1% (W/V) 用时由母液 2 mol/L NaOH 、 10