秸秆蓝藻混合发酵产沼气过程中微生物群落分析.docVIP

PAGE 1 秸秆蓝藻混合发酵产沼气过程中微生物群落分析 　　摘要：采用实验室自制秸秆蓝藻混合厌氧反应装置进行沼气发酵实验，利用16S rＲNA基因克隆文库的方法，对不同产气阶段的细菌和古菌的优势菌群进行多样性研究。结果表明：①不同产气阶段细菌优势种类存在差异，供试秸秆沼气反应器阶段细菌种类较为丰富，分属于6个门：产气初始阶段优势菌群为变形菌门（Proteobacteria），相对丰度为51.76%；产气高峰阶段优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度为47.13%；产气结束阶段优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度为28.89%；此外，还包括绿弯菌门、螺旋体门、绿菌门的细菌。②古菌种类明显少于细菌，均属于甲烷微菌纲（Methanomicrobia）、甲烷杆菌纲（Methanobacteria）和热原体纲（Thermoplasmata）。秸秆蓝藻沼气系统微生物群落结构的阐明具有一定的意义，可为秸秆沼气工程调控提供科学依据。 　　安徽省作为农业大省，每年都有大量的秸秆产生，主要农作物秸秆年理论资源量达4487.99万t，年可收集资源量达3878.84万t[1]。秸秆作为农业生产中的副产品是一种容易获取的生物能源，然而大量的秸秆被随意丢弃和焚烧，造成了极大的资源浪费和环境污染[2]。巢湖是中国第五大淡水湖，连通长江，巢湖的水质不仅会影响到其周边环境，还会影响到整个长江流域。巢湖水体近年来富营养化严重，蓝藻暴发成为环境问题。 　　蓝藻含丰富的有机质，是一种生物质资源[3]。厌氧发酵可以使秸秆和蓝藻转化为清洁能源，既保护了环境也使资源得到了利用[4]。秸秆是一种富含木质纤维素与其他多糖的有机质，而蓝藻中含丰富的蛋白质和藻多糖，利用含氮量比较丰富的蓝藻调节底物的碳氮比，可以提高发酵的效率[5-6]。彭书传等利用玉米秸秆和巢湖蓝藻进行混合厌氧发酵，与单一的玉米秸秆或蓝藻发酵过程相比，玉米秸秆和蓝藻混合发酵能够有效促进沼气的生成[7]。有机物厌氧降解过程主要分为水解发酵、产氢产乙酸及产甲烷3个阶段。其中水解发酵与产氢产乙酸阶段主要由细菌参与，涉及一系列复杂的化学代谢过程，生成乙酸等挥发性有机酸；而产甲烷阶段主要由甲烷古菌参与，将乙酸转化为甲烷[8]。沼气发酵过程需要不同阶段的微生物相互协作完成，因此沼气发酵过程中的微生物群落结构和功能的解析已经成为研究的热点[9]。目前国内外关于利用秸秆进行发酵的微生物群落研究主要集中在秸秆和禽畜粪便等常规原料的混合上[10]，而以秸秆和蓝藻混合发酵为对象的研究鲜有报道。分子生物学技术在微生物鉴定方面的应用，可以研究微生物在厌氧发酵过程中变化情况[11-13]。本文在秸秆蓝藻混合厌氧产气的基础上，通过构建16S rＲNA基因克隆文库，了解混合发酵不同阶段的细菌和古菌的优势菌群及其变化规律，为调控混合发酵过程提供微生物基本信息。结合不同产气阶段的产气率，解析沼气发酵各阶段优势微生物的功能，为优化秸秆沼气发酵工艺提供理论依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1实验材料 实验所用水稻秸秆采自安徽省周边某稻田，总固体（TS）含量为91.1%，挥发性固体（VS）含量为85.9%，晒干后剪至1cm左右待用；新鲜蓝藻采自巢湖塘西河口，总固体（TS）含量为1.96%，挥发性固体（VS）含量为91.58%，经滤网滤水后装入自封袋置于冰箱冷冻备用，实验时常温解冻待用；接种污泥采自实验室35℃中温厌氧发酵反应器剩余污泥，TS=3.9%，VS=72.51%，pH=7。 　　1.1.2实验装置 实验装置主要由发酵瓶、集气瓶、集水瓶组成（见图1）。 　　1.2方法 　　1.2.1发酵与取样 将处理后秸秆与解冻新鲜蓝藻按碳氮比为251混合成发酵原料。将原料分别置于4L厌氧发酵罐中，加入500mL厌氧污泥，配水至2.5L，调节反应总底物的pH至（7.0±0.05）。混匀后装入反应器内，用氮气对整个装置进行吹氮除氧0.5h以上。密封后进行厌氧发酵，发酵温度35℃，每天保证人为手动振荡摇晃发酵瓶2～3次，防止颗粒污泥沉淀或秸秆蓝藻浮于液面。共采样3次，分别在第1、7、29天取样，将样品依次命名为d1、d7、d29。样品采集前，先排空采样管道中残余的厌氧污泥，然后再将厌氧污泥向外流动几分钟后从反应器中取固液混合样30mL装入无菌聚丙烯离心管中，冻存于－80℃超低温冰箱。 　　1.2.2常规测试方法 TS：105℃烘至恒重；VS：于550℃马弗炉中烧至恒重；沼气产量：采用水压集气法，每日测量排出的饱和食盐水总量；甲烷含量：采用安捷伦7890A气相色谱测定。 　　1.2.3基因组DNA提取 基因组DNA的提取采用QIAamp DNA Stool mini kit基因组提取试剂盒。为了保证提取样品的