2021年肝糖原测定实验报告.docVIP

2021年肝糖原测定实验报告 2021年肝糖原测定实验报告 PAGE / NUMPAGES 2021年肝糖原测定实验报告 肝糖原提取、 判定与定量 一、 试验目 1. 掌握组织样品制备方法, 了解其注意事项。 2. 了解肝糖原提取、 糖原和葡萄糖判定与蒽酮比色测定糖原含量原理和注意事项, 掌握其操作方法。 3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4. 熟练利用溶液混匀多种方法（视具体情况, 采取适宜混匀方法）。 5. 正确掌握溶液转移操作。 6. 正确操作使用分光光度计。 二、 试验原理 （一）肝糖原提取、 判定 糖原储存于细胞内, 采取研磨匀浆等方法可使细胞破碎, 低浓度三氯醋酸能使蛋白质变性, 破坏肝组织中酶且沉淀蛋白质, 而糖原仍稳定地保留于上清液中, 从而使用糖原与蛋白质等其它成份分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水, 故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀, 再溶于热水中。 糖原水溶液呈乳样光泽, 遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成螺旋中, 依靠分子间引力吸附碘分子后展现颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖, 利用呈色反应和葡萄糖还原性, 可判定肝组织中糖原存在。 CuSO4十2NaOH ═ Na2 SO4+Cu(OH)2↓ 2Cu(OH)2十C6H12O6 ═ 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O 2CuOH ═ Cu2O↓(红色)+H2O Cu(OH)2 ═ CuO↓(黑色)+H2O （二）肝糖原定量 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖, 浓硫酸能使葡萄糖深入脱水生成糠醛衍生物—5-羟甲基呋喃甲醛, 此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10-100μg范围内, 溶液颜色深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与一样处理已知葡萄糖含量标准溶液比色, 经过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定, 故在显色之前, 肝组织先置于浓碱中加热, 以破坏其它成份, 而保留肝糖原。 三、 材料与方法: 以步骤图示意 试验材料: （一）仪器 1. 一般离心机, 室温?100℃恒温水浴箱（×2）, 分光光度计, 精度为10mg级电子天平（×1） 2. 剪刀（×1）, 镊子（×1）, 研钵（×1） 3. 试管架（×1）, （100×15）mm试管（×3） 4. 刻度吸量管（2mL×1, 5 mL×2）, 1000μL微量可调取液器（×1） 5. 100mL容量瓶（×1） 6. 白瓷反应板（×1） （二）试验样品和试剂 1. 鸡肝。 2. 95％乙醇。 3. 0.31mol/L(5％)三氯醋酸溶液。 4. 0.15mol/L NaCl溶液。 5. 12mol/L HCl。 6. 12.5mol/L(50％)NaOH。 7. 碘试剂。 8. 班氏试剂。 9. 5.35mol/L(30％)KOH溶液。 11. 标准葡萄糖液(50mg/L)。 12. 17mol/L(90％)H2SO4(用于制备蒽酮显色剂）。 13. 蒽酮显色剂: 称取蒽酮0.20g, 用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。此试剂不稳定, 以当日配制为宜, 冰箱保留可用4-5d。 试验方法: 吸收1mL量溶液时使用可调微量取液器, 吸收1mL以上量溶液时使用刻度吸量管。 肝糖原提取与判定 操作步骤以下: 鸡肝约1.0g, 剪碎 ＋5%CCl3COOH 1 ml 研磨至乳状 ＋5%CCl3COOH 3 ml 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中, 离心3分钟（4000 r / min） 沉淀（弃去） 上清（取2 ml） ＋2ml 95%乙醇, 混匀, 静置10分钟 离心5分钟（4000 r / min） 上清（弃去） 沉淀 ＋蒸镏水1 ml 沸水浴2分钟, 溶解沉淀 白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml ＋浓HCl 5滴 加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟, 冷却 糖原溶液2滴 ＋50%NaOH 5滴 呈色对比 糖原水解液2滴 糖原水解液 ＋班氏试剂4滴 混匀 沸水浴2分钟, 观察改变 注意事项 1. 肝糖原提取一步, 向上清液中加入95％乙醇后, 务必注意混匀。因为上清液为水溶液, 比重大于95％乙醇, 溶液分成两层。总量相对较多, 混匀操作比较困难, 最好用倾倒混匀, 也可用滴管或吸量管吸、 吹混匀, 或用玻璃棒搅拌混匀。 2. 糖