cck操作说明与检测步骤.pdfVIP

D O J I N D O 操 作 说 明 细胞活性检测 1.?在96?孔板中接种细胞悬液?(100 ml /孔?)?。将培养板放在培养箱预培 ?(在37?℃，5% CO2 的条件 下?)。 2.?向每孔加入10 ml?的CCK- 8 溶液?(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响?值的读数)?。 3.?将培养板在培养箱内孵育?1-4 小时。 4.?用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。 5.?如果暂时不测定值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入?10 ml M HCl 溶液或者1% w/vSD ?溶液， 并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在?24 小时内吸光度不会发生变化。 细胞增殖?-毒性检测 1.?在96?孔板中配制?100 ml 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培 ?24 小时?(?在37℃，?5% CO2 的条 件下?) 。 2.? 向培养板加入10 ml 不同浓度的待测物质。 3.?将培养板在培养箱孵育一段适当的时间?(例如: 6,12, 24?或48 小时?)。 4.? 向每孔加入10 ml CCK-8?溶液?(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响?值的读数)? 。 5.?将培养板在培养箱内孵育?1-4 小时。 6.?用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。 7.?如果暂时不测定值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入?10 ml M HCl 溶液或者1% w/vSDS?溶液， 并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在?24 小时内吸光度不会发生变化。 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加?CCK-8 之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当 然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 制作标准曲线 1.?先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2.?按比例?(?例如：1/2 比例?)?依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做?3-5 个细胞浓度 梯度，每组3-6 个复孔。 3.?接种后培 2-4?小时使细胞贴壁，然后加?CCK-8 试剂培养一定时间后测定?值，制作出一条以细胞数 量为横坐标?(X 轴)?，值为纵坐标?(Y 轴)?的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数 量?(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入?CCK-8 后的培 养时间) 。 DOJINDO 检测步骤 CCK-8 检测步骤 1. 向各孔中加入100 μl 细胞悬液。a) 2. 在37℃下预孵育培养板。b) 3. 向各孔中加入各浓度的待测溶液c)10 μl。 4. 37 ℃下孵育。 5. 向各孔中加入10 μl 的CCK-8 溶液d) 。 6. 37℃下孵育1-4 小时。e) 7. 测定450 nm 处的OD 值。 a) 使用适当的培养基制备50,000-100,000 个/ml 的细胞悬液。 b) 建议使用CO2 培养箱过夜预培养。 c) 使用培养基或PBS来制备溶液。 d) 如果待测溶液有还原性，测定不含细胞，但含有CCK-8 的待测溶液在450 n 处的空 白吸光度。如果该吸光度很小，则可以直接加入CCK-8 ，如果吸光度相对较大，则需 要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100 μl 培养基和10 μl CCK-8 进行检测。 e) 白细胞可能需要培养较长时间。 活力计算 细胞活 * （％）=[A(加药)-A （空白）]/[A （0 加药）-A （空白）] ×100 A （加药）：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度 A （空白）：具有培养基和CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度 A （0 加药）：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 *细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活 问答： 1.一个孔中应接种多少个细胞？ 当使用标准96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵 敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,5