蛋白质高效液相色谱技术.pptVIP

高效液相色谱法在蛋白质分离中的应用 陈 檬 S1030624 张双健 S1030621 郭传龙 S1030622 石晨阳 S1030623 汪菊芬 S1030625 高效液相色谱技术特点概述 1 HPLC系统各组分介绍； 2 流动相的要求及准备过程 3 5 4 HPLC色谱技术与其他技术联用 5 HPLC 应用举例 6 现状与展望 6 应用 范围广 高灵 敏度 高效 高压 分析速 度快 HPLC是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。 根据分离机理蛋白质HPLC又可分为 1 2 4 3 高效凝胶过滤色谱(HPSEC) 高效离子交换色谱（HPIEC） 高效亲和色谱（HPAFC） 反向高效液相色谱（RP-HPLC） 高效液相色谱仪 常用的HPLC仪 Waters公司 Agilent公司 岛津公司等 一 进样系统 进样方式 隔膜进样 *阀进样 自动进样 停流进样 六通阀进样 高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。 上样 分析 开始分析 废液 样品 淋洗液 至分离柱 进样阀 样品 装样 废液 淋洗液 至分离柱 定量环进样 （ＬＯＡＤ） （ＩＮＪＥＣＴ） 样品环 进样方式 部分装液法 进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同 。 缺点是易产生由进样引起的峰展宽 完全装液法 进样量应不小于定量环体积的5~10倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性 二 输液系统 在线脱 气装置 梯度仪 高压输 液泵 输液系统 高压输液泵 输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其作用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性 。 流量稳定 流量范围宽 输出压力高 液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀 柱塞往复泵 流量不受柱阻影响 泵压可达400kg/cm2 输出的脉冲性较大，现多采用双泵 系统来克服 液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗更换流动相，特别适合再循环和梯度洗脱 三 分离系统 分离系统 *色谱柱 连接管 恒温器 色谱柱 柱效高 选择性好 分析速度快 进入色谱柱样品的处理 柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。 ①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 ②应逐渐改变溶剂的组成 。 ③一般说来色谱柱不能反冲 ，会迅速降低柱效。 ④　选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。 ⑤　需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。 ⑥　经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。 柱的使用和维护注意事项 四 检测系统 要求 灵敏度高 噪音低 适用范围广 重复 性好 UV 检测器 数据处理和计算机控制系统 恒温装置 在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。 采集处理分析数据 控制 仪器 色谱系统优化 流动相的要求 反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用的是甲醇和乙腈。一般情况下甲醇-水已经能够满足多种样品的分离，粘度小，价格低。但推荐乙腈-水做初始实验，与甲醇比，乙腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185-205nm处检测的要求。 与检测器相适应 溶剂的纯度 粘度小 沸点低固体残留物少 与色谱系统相适应 流动相的准备 调整PH 根据所分离蛋白质及色谱柱决定 流动相脱气 滤膜过滤 目前实验室主要用的是超声15min左右 溶剂使用前都必须经0.45μm滤膜过滤，以除去杂质微粒。分清有机相滤膜和水相滤膜，对于混合流动相，在混合前过滤 合适的波长 合适的柱温 蛋白样品的性质 HPLC与其他色谱光谱技术的联用 CE MS UF CE CE MS HPLC * * 美国沃特世，安捷伦，日本的岛津公司 流动相参与样品与固定相之间的相互作用，使样品在流动相和固定相之间以不同的形式进行分配，根据被分离的样品和固定相的性质合理选择流动相显得