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精品文档 选修 1 《生物技术实践》 第一部分 微生物的利用 实验1大肠杆菌的培养和分离 一、大肠杆菌 1．大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，为兼性厌氧的肠道杆菌。 2．用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。 二、本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。 本实验用LB液体培养基 （通用的细菌培养基）扩大培养大肠杆菌，培养后用LB固体平面培 养基进行划线分离。 三、细菌的培养和分离 1．细菌的培养： （1）繁殖方式：细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20min分裂一次。 （2）培养的方法：需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用接种环来转移带菌的培 养物。 2．细菌的分离 分离的方法与特点： 划线分离法：操作简单。（接种环） 涂布分离法：操作复杂，单菌落更易分开。（玻璃刮刀） 四、灭菌操作 1．灭菌操作的原因：获得纯净的培养物的关键是防止外来杂菌的入侵污染。 2．无菌操作的条件： （1）各种器皿必须是无菌的。（首要条件） （2）各种培养基必须是无菌的。 “细菌喜荤，霉菌喜素” 细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定量的氯化钠，以维持一定的渗透 压。在中性偏碱的环境中生长（制备培养基时需调节培养基的酸碱度）。 霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。在中性偏酸的环境中生长（制备培 养基时需调节培养基的酸碱度）。 精品文档 精品文档 2 如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/c 压力（90 ℃以上）灭菌30min. 3．灭菌的方法：是指杀灭病原微生物的方法。 （1）灼烧灭菌 （2）干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。 2) （3）高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃(1kg/c 下维持15min. （4）过滤灭菌：G6玻璃砂漏斗过滤（用于有些不能加热灭菌的化合物，如尿素加热会分解） 4．消毒的方法：是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法 （1）煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min （2）巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min （3）化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 （4）紫外线消毒 五、大肠杆菌的培养和分离实验 1．实验步骤： （1）培养基灭菌：将50mlLB液体培养基、50mlLB固体培养基加上封口膜和培养皿用牛皮纸包好 进行高压蒸汽灭菌。（封口膜的作用是既通气又不使菌进入） （2）倒平板：将有培养基的三角瓶和培养皿放 超净台上，打开紫外灯和过滤风 （3）接种：接种环接种，在37℃振荡培养12h （4）划线分离：在酒精灯火焰上灼烧接种环，接种环只在菌液中蘸菌液一次，然后在固体培养基 的平板上连续划线，盖好培养皿，将培养皿倒置，放在 37℃恒温培养箱中培养 12-24h，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落。 （5）菌种保存：用接种环取出单菌落，用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱 中保存 精品文档 精品文档 实验2分离以尿素为氮源的微生物 一、脲和脲酶 1．脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。 2．脲酶：有些细菌可以尿素为氮源，这些细菌含有脲酶 （1）可降解尿素的酶 （2）作用原理：细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH ，致使pH升高，使酚红指示剂变红。 3 二、实验设计及步骤 1．实验中的对照设置： 实验组：以全营养LB固体培养基进行培养（蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂糖，水） 对照组：以尿素固体培养基进行培养（葡萄糖，氯化钠，KHPO ，酚红，琼脂糖，水） 2