基因功能研究方法.ppt

整理课件 目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下: (1) 克隆基因组中某一基因的全部或部分DNA 序列, 用插入、删除、置换、修饰等手段重建DNA 序列,使之成为靶载体; (2) 将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的DNA 序列整合到内源基因组中; (3) 将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚,将这些囊胚导入假孕母鼠子宫中,产生的雄性嵌合鼠子代与正常的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠,进而分析被剔除基因的功能。 4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强有力手段,但对于许多基因来说,简单的失活常导致令人费解的无改变的表型。最常见的解释是某些其它基因取代了靶基因的功能,但要在普通基因敲除小鼠中证明这一点十分困难。基因敲入即通过基因打靶用一种基因替换另一种基因以确定它们是否具有相同功能。 基因敲入的设计,是一个类似于普通基因敲除法的一步同源重组过程。不同之处在于,设计打靶载体时需将靶基因第一个外显子的N-端序列缺失,并将新的替换基因置于靶基因的调控序列之下,使其能精确地按照靶基因的调控模式表达。此方法不仅能用一种基因置换另一种基因,且可以系统地改变基因的结构,分析其蛋白产物各功能区的作用。 6.人工染色体的转导 转基因技术是进行蛋白功能分析和基因表达调控的有力手段,但使用小的质粒重组体存在表达水平低、缺乏组织特异性等缺点,若将大的DNA片段克隆入酵母人工染色体( YACs)或细菌染色体，可产生较好的表达水平和组织特异性,并可精确地调节同源重组。 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受100-1000kb的外源DNA片段。 基因功能研究方法 随着生物学研究在分子水平上的不断深入和推进，越来越多的新基因得以成功克隆，对新基因功能的研究显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组学的重要研究内容。 1. 微阵列分析 微阵列(microarray) 是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、DNA 序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项研究基因功能的新技术。它包括cDNA微阵列(cDNA microarray)和DNA芯片。 原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微阵列就称为DNA芯片。 微阵列法分析过程 首先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA 作为模板,以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录合成cDNA。再用所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交,然后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可以知道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达水平低。 芯片的制作 目前常用的基因芯片制作方法： 接触点样法、喷黑法、原位合成法。 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器，可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。 喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。在1cm2面积上可喷射10000个点。 原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸原位光刻DNA合成技术。 采用的技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5’端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长，在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。 信号检测与结果分析 激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号 软件进行进行图象分析和数据处理 2. 基因转导技术 基因转导是将目的基因转入某一细胞中,然后观察该细胞生物学行为的变化,从而了解该基因的功能。这是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法之一。但因基因的表达受转导效率和是否持续稳定表达两方面因素的影响。