exp重组质粒的酶切.pptxVIP

Exp重组质粒的酶切会计学二、实验原理?BamHI单切?EcoRI PstI 三、实验器具、药品器具和材料?1.5ml EP管,移液器及枪头(10、50?l)?恒温水浴、电泳仪、电泳槽?重组质粒pMD18-T试剂?限制酶: BamHI、EcoRI和PstI?酶切buffer: 10?K、10?H?DNA marker: ?-HindⅢ?琼脂糖,1?TAE, 上样buffer四、实验步骤1. 酶切反应步骤 ?ddH2O于EP管→10?buffer→质粒DNA→限制酶→混匀,离心5s→37℃, 50?→65℃水浴10? (1) 单酶切反应成分ddH2O10? K BufferDNABamHITotal 需量(?l)7.52100.520?BamHI (15U/?l)?组/4人; 30℃, 50? (2) 双酶切反应成分ddH2O10? H BufferDNAEcoRIPstI需量(?l)7.52100.250.25?EcoRI PstI (15U/?l)?组/4人; 37℃, 50? 2. 凝胶电泳检测 ?0.8%Aga,30ml TAE,煮沸?冷却至55℃,2?l EtBr?倒胶,插梳子,凝固20??2?l上样液+样品?100V电泳,观察酶切失败的可能原因 不全切或基本未切?缓冲体系不合适?酶量过多?样品杂质含量高DNA被降解?痕量DNase注意事项①吸量要准确②最后加酶③冰上操