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质粒构建流程 质粒构建流程 一、 引物设计 1） 取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2） 软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位 点，即为可用没切位点。 3） 选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1（+）, 4） 选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者 共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用 酶切位点。 5） 使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱 基。 6） 根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设 计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。 7） 引物设计完成，送公司合成。 二、 目的片段获取 1. RNA提取 试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL4C°、漂洗 液RW -20C。保存） 准备：冰盒、4C。预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA-套 操作步骤： 1） 将1000卩1裂解液RL加入细胞中，混合5mino 2） 加200卩1氯仿混合，震荡15s,室温孵育3min。 3） 4C°, 12000rpm 离心 10mine 4） 最上层水相转移至新EP管中（体积约550pl） 5） 加入1倍体积（550卩1） 70%乙醇,混匀 6） 全部转移