山羊和黄牛源性成分同步检测方法实时荧光PCR法编制说明.pdf

编制说明 项目名称： 山羊和黄牛源性成分同步检测方法 实时荧光 PCR法 项目编号： 内质监标函〔 2018〕307 号 编制单位： 锡林郭勒职业学院 一、工作简况 本项目来源于 2018 年第 3 批内蒙古自治区地方标准制修订项目 （内质监标函〔2018〕307 号）。起草单位为锡林郭勒职业学院，协 作单位为锡林郭勒食品检验检测和风险评估中心。主要起草人：郭 梁、郭元晟、廖成松、雅梅、钱俊平、罗建兴。 二、制定标准的必要性和意义 山羊奶深受消费者的喜爱， 是农畜产品市场中重要组成部分。 市 场中存在用低价牛奶冒充山羊奶的欺诈违法行为， 亟需制定针对肉乳 制品的山羊和黄牛源性成分同步检测方法。 目前，已经存在一项山羊 源性检测方法标准： 动物产品中牛、 山羊和绵羊源性成分三重实时荧 光 PCR 检测方法（ SN/T 2980-2011）。在采用上述检测标准后发现： 目前缺乏基于同管质量控制体系、 针对肉乳制品的山羊和黄牛源性成 分同步检测方法的相关标准。本标准是基于多重实时荧光 PCR 法、 同管质量控制体系、 针对肉乳制品的山羊和黄牛源性成分同步检测方 法的相关标准，具有快速、高通量以及去除假阴性等特征。 三、主要起草过程 本标准制定工作从 2018 年 10 月开始，组织成立了标准起草团 队。起草团队首先进行相关标准、专利以及论文的收集和整理工 作，制定了基于多重实时荧光 PCR 法、同管质量控制体系、针对肉 乳制品的动物源性成分检测标准体系的研发目标，计划形成山羊 （Capra hircus ）、黄牛（ Bos taurus）、绵羊（ Ovis aries）、马 （Equus caballus）、水牛（ Bubalus bubalis）、牦牛（ Bos grunniens）、猪（ Sus scrofa）、驴（ Equus asinus）、双峰驼（ Camelus bactrianus）、梅花鹿（ Cervus nippon）、鸡（ Gallus gallus）、鸭 （Anas platyrhynchos）及鹅（ Anser anser）等 13 个物种、针对肉 （鲜肉、肉干及香肠）和乳（鲜乳、发酵乳、乳酪及乳粉）的常见 动物源性成分检测标准体系。 具体实验过程如下： （一） 在 NCBI 中下载不同物种（山羊、黄牛、绵羊、马、水 牛、牦牛、猪、驴、双峰驼、梅花鹿、鸡、鸭及鹅等 13 个物 种）的线粒体序列。为了保证引物和探针的物种适用性，每个物 种下载 5-20 个品种或品系的线粒体序列；利用生物信息学软件 （Clustal X 或 MAGE 5 ）对所下载的线粒体序列进行比对。筛选 物种间特异品种间保守的序列为目标靶向区域（ 5-10 个），针对 目标靶向区域设计 5 组引物和探针组合。上游引物的 3’端距离探 针的 5’端为 1-20 bp，探针的 5’端避免出现 G ，探针 Tm 要高于引 物 Tm 值 10℃左右；不同物种的探针用不同的荧光基团标记 （FAM 、HEX 、ROX 以及 CY5 ）；如果探针 Tm 值和引物 Tm 值 接近，探针 3’端可以选择 MGB 基团； （二） 收集各种来源于不同动物的肉（鲜肉、肉干及香肠）和乳 （鲜乳、发酵乳、乳酪及乳粉）。利用改良 CTAB 法提取样品的 DNA （A260 nm/A280 nm ≈ 1.8，琼脂糖凝胶电泳主带无拖