《基因工程基因工程的基本条件载体系统》ppt课件讲义.ppt

?噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定 限度的，控制在野生型?-DNA长度的75%-105%之间。 在这一范围内的DNA可被包装成有活性的?噬菌体颗 粒，而超出了这个范围的就不能形成正常大小的噬 菌斑。 包装限制说明?噬菌体载体克隆外源DNA的能力不 是无限的，有一个极限值。 λ噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆DNA 片段。构建cDNA文库和基因组文库,并从中筛选目 标基因是λ噬菌体载体一般用途，也可用于亚克 隆在大容量载体（如粘粒）中增殖的外源DNA片段。 4.用λ噬菌体进行克隆 在构建基因文库时，不同的重组噬菌体DNA经过 裂解生长过程最终形成大量的噬菌斑。 这些噬菌斑的集合，就构成了基因文库。而质粒 载体构建的文库是以菌落的形式存在的。 5.λ-DNA及其重组分子的分离纯化 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期； 加入λ噬菌体或重组λ噬菌体的悬浮液，37℃培养1小时； 用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。密度已达1013 -1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解； 超速离心，沉淀噬菌体； 苯酚抽提，释放λ-DNA； 乙醇或异丙醇沉淀λ-DNA。 6.λ-DNA作为载体的优点 λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌； λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量； 重组λ-DNA分子的筛选较为方便； 重组λ-DNA分子的提取较为简便； λ-DNA载体的适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达。 2700个外壳蛋白分子 (四)大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA 1.M13噬菌体的生物学特性 生物结构 M13噬菌体的外型呈丝状； M13噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成； M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长； M13 DNA全长6407个核苷酸； M13 DNA上至少有10个基因。 +DNA (+)DNA RFDNA RFDNA II V 感染周期 -DNA III VI I IV II X V VII IX VIII III VI I IV II X V VII IX VIII lacZ‘ polylinker 2.M13噬菌体的构建 野生型M13RF-DNA M13mpn系列载体 3.M13噬菌体的特点 使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞 外,这在DNA定向突变中非常有用； M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细 胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重 组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大； 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb； II I 基因间区段(507bp) (五)考斯质粒和噬菌粒 λ-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb 和1.5kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源 DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一 步提高噬菌体DNA的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长 度，就能同步增加载体的装载能力。 将噬菌体DNA与包装有关的序列和质粒组装在一起，既 能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分 子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯 质粒和噬菌粒载体的思路。 pHC79 6400 bp Tcr λfragment cos ori Apr PstI BamHI SalI 1.考斯质粒(cosmid)载体的构建 考斯质粒是一类人工构建的含 有λ-DNAcos序列和质粒复制子的 特殊类型的载体； 装载范围为31-45kb。 1978年Collins和Hohn发明构 建1.8kb的λ-DNA片段+pBR322 片段； 2.考斯质粒的特点 能像λ-DNA那样进行体外包装,并高效转染受体细胞； 能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 重组操作简便,筛选容易； 装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围； 不能体内包装,不裂解受体细胞。 3.噬菌粒的特点（phagemid or phasmid） 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、 复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊 类型的载体。 能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞； 能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 装载量比常规的M13mp系列要大很多(10kb)； 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA； 重组操作简便，筛选容易。 pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG 500 个拷贝 MCS lacZ’ lacI ori Apr M13-IG pU