蛋白质一级结构测定精品课件.pptVIP

蛋白质的一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。 自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作 A. 样品必需纯（97%以上）； B. 知道蛋白质的分子量； C. 知道蛋白质由几个亚基组成； D. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 E. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。 （1）测定蛋白质的一级结构的要求 （2）蛋白质分子的一级结构测定方法 氨基酸组成分析 氨基酸末端分析 蛋白质中肽链的拆离 肽链的部分降解及肽片断的分离 肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠 二硫键与酰胺基的定位 ①测定蛋白质氨基酸残基组成 根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨基酸的数量； 采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。 ②测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分离出来； 几条多肽链通过二硫键交联在一 起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基； 用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试剂保护生成的巯基，防止其重新被氧化； 如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。 ③二硫健的断裂及多肽链的拆分 ★巯基的保护 用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化 用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析仪测定； 测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用Edman反应分析各肽段氨基酸顺序； ④多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺序的测定 获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序；确定多肽链中二硫键的位置。 ⑤利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解 2、多肽链氨基酸顺序分析 多肽链降解必须满足两个条件： 选择性强、反应产率高 主要方法包括酶解法和化学法 某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的某一类肽键； 主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶； 糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸； 胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、以及其他疏水性强 酶解法 特点：专一性较强，水解速度快 断裂位点：赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键 R1=Lys（赖、K）和Arg（精、R） R2=Pro（抑制） 胰蛋白酶（trypsin） 特点：专一性稍弱，Leu、Met和His稍慢 断裂位点：Phe（苯丙）、Trp（色）、Tyr（酪）等疏水氨基酸残基的羧基端肽键 R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA R2=Pro（抑制） 糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin） 水解速度与相邻AA性质有关: 酸性：-/碱性：+ 特点专一性与糜蛋白酶相似，较弱； 断裂位点：两侧的残基都是疏水性氨基酸 R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 R1=Pro（抑制） pH2.0 肽链 水解位点 胃蛋白酶 Pepsin 特点：专一性较差 断裂位点：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏水性强氨基酸残基的羧 基端肽键 R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快 嗜热菌蛋白酶（thermolysin) 木瓜蛋白酶： 专一性差 断裂位点：对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感 葡萄球菌蛋白酶： 高专一性 断裂位点：Glu和Asp残基的羧基端肽键 ——磷酸缓冲液 Glu残基的羧基端肽键 ——碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液） 梭菌蛋白酶： 高专一性 断裂位点：Arg残基的羧基端肽键 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 化学法 ---选择性地切割由Met羧基形成的肽键 溴化氰水解法(Cyanogen bromide) N末端的测定 二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL 法）；异硫氰酸苯脂法（PITC 法）； C末端的测定 羧肽酶法