微生物实验方案.docxVIP

第 PAGE \* Arabic 4 页 实验器材 原料：醪糟： 1.2 主要培养基 PDA（马铃薯－葡萄糖－琼脂培养基）培养基；YPD培养基（酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基）；高盐察氏培养基；普通营养琼脂，LB琼脂培养基 1.3仪器 超净工作台、恒温干燥箱、恒温培养箱、光学显微镜，培养皿，三角瓶，无菌枪头，平板，接种环，无菌生理盐水试管 2 试验方法 2.1 培养基配制及培养条件 2.2 菌种的分离纯化 2.2.1 菌种的分离方法 无菌操作称取样品1g，放入盛有99mL无菌水的三角瓶中，振摇1-2min，浸泡数分钟后再振摇1-2min，使样品与水分充分混合，将菌分散。使用无菌枪从原菌液中吸取1mL 样液注入盛有9mL的无菌水的试管中，以此类推，制成10-3、10-4和10-5稀释度的样品溶液。用无菌枪分别从中稀释度的试管中吸取1mL 放入PDA、YPD、LB 琼脂培养皿中，在培养基未凝固前（37℃）快速将样品液摇匀，同时制作空白，每个稀释度制作三个平板，将平板倒置后放入28℃培养箱中培养。 2.2.2 菌种的纯化方法 培养3d后观察平板内菌落，按其形态进行初步分类，挑选典型菌种的单菌落2-3个，酵母菌采用划线法接种于琼脂平板， 霉菌采用点种法接种于PDA 平板，经过多次分离后菌种得到纯化。 革兰氏染色实验步骤 1、 取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、 涂片： 液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基：1.先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、 晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5、 染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。 6、 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 7、 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。 9、 复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束 2.2.3 菌种的保藏 经分离纯化后的优势纯培养菌种，为了做菌种鉴定及后期的产品试验，必须进行有效保藏，防止菌种退化或变异。霉菌的保藏方法；用点种法接种于PDA平板上，48h后观察，看到菌丝生长并在平板上延伸时，用接种环挑取菌丝接种于PDA斜面试管中，在28℃培养箱中培养3-4d，待产生孢子后用牛皮纸扎好存储于4℃冰箱中待用。 2.2.4 优势菌种的确定 采用平板菌落计数统计样品微生物菌落数并用血球计数板进行活菌总数计数，依据数据确定出优势菌种。 2.2.5 菌种的初步鉴定 2.2.5.1霉菌的初步鉴定 （1）菌落特征观察 用以无菌接种方式挑取测试菌株少量孢子，以三点接种法点接于PDA 培养基上。每个稀释度菌种重复2个平皿，倒置于28℃下培养4-7d。观察各菌种的菌落特征，包括颜色、质地、高度。 （2）镜检 培养物直接镜检：在长有上述菌株的平板上挑取少量菌株制片并置于低倍显微镜下，分别观察它们的孢子囊梗的形状排列、着生位置、分支情况及孢子囊的形状，并注意有无假根等特征。接合孢子观察方法：用无菌接种环挑取测试菌株的少量孢子或菌丝，分别以“八”字形排列划线接种在同一PDA培养基平板的两侧，倒置于28℃培养4-5d。培养物制片观察：制片介质为乳酸苯酚液。 活体观察法：用接种针挑取少量霉菌菌丝于载玻片上，快速滴一滴PDA 培养基，让菌丝均匀分布，盖上盖玻片，放入大培养皿中置于28℃培养箱培养，每天观察。 2.2.4.2 酵母菌的初步鉴定 （1）菌落特征观察 将菌种用划线法接种到YPD 培养基上，每个稀释度菌种重复两个平皿，倒置于28℃下培养3-7d，观察各菌落形态、颜色、边缘形状、隆起度。 （2）镜检 培养物直接镜检：将长有上述菌株的平板挑取少量菌丝用水浸法制片并置于低倍显微镜下观察酵母菌细胞形状、有无出芽、芽体形状大小、子囊孢子形状是否有结合现象。 酵母假菌丝的观察：将已活化好的酵母划线于YPD 琼脂培养基平板上，每个平板划2-3 条，在菌线上盖以无菌盖玻片，28℃培养5-10d。镜检是否有假菌丝。 酵母菌活体观察： 将已活化好的酵母用接种针挑取少量于载玻片上，快速滴一滴YPD 培养基，让菌丝均匀分布，盖上盖玻片，放入培养皿中置于28℃培养箱培养，每天观察记录。 培养基的制备 PDA（马铃薯－葡萄糖－琼脂培养基）培养基；。 配料：马铃薯 200