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分子生物学设计性实验 ----实验报告 实验课题：EcoRV 和 Pvu II 限制性核酸内切酶对质粒 DNA 的切割 学 院： 班 级： 学 号： 姓 名 ： 指导老师： 实验时间： 实验单位： Digestion of plasmid DNA with EcoRV and Pvu II restriction endonuclease ----Digestion of pUC19-P35S:ARF8 with Enzyme EcoRV and Pvu II (JinhongChen) From School of Life Sciences ,Guangzhou University EcoRV 和 Pvu II 限制性核酸内切酶对质粒 DNA 的切割 ---- EcoRV 和Pvu II 限制性核酸内切酶对pUC19-P35S:ARF8 切割 广州大学生命科学学院 2014 级生物科学专业方向 摘 要：为加深对限制性内切核酸酶切割质粒 DNA 的位点特异性和其专一性的认识， 采用 EcoRV 和 Pvu II 两种酶双酶切割质粒 DNA，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA 具有不同的切割结果。本实验通过用 EcoRV 和 Pvu II 限制性核酸内切酶共同对pUC19-P35S:ARF8 进行切割，再用 1%琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。结果出现了6 个DNA 条带，大小分别为 862bp、1581bp、176bp、1305bp、 686bp、2366bp，结果与预期不一致，发现 EcoRV 酶有两个酶切位点。 关键词 EcoRV 和 Pvu II 内切酶 pUC19-P35S:ARF8 切割 琼脂糖凝胶电泳 引言 限制性核酸内切酶主要存在于原核生物，它能将外来的 DNA 切断，即能够限制 异源 DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的 DNA 却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。它不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase），限制性核酸内切酶的切点大多很严格，要求专一的核苷酸序列。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链 DNA。限制性核酸内切酶按其性质可分为三大类，即所谓Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型酶。[1]其中Ⅰ型和Ⅲ型水解核酸要消耗 ATP，它既特异性切割核酸又能给特殊碱基加上甲基基团进行修饰，但特异性弱，切割位点不固定，Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA， 而Ⅲ类酶在识别位点上切割 DNA 分子, 然后从底物上解离；Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ型水解核酸不需要消耗 ATP，它只特异性切割核酸并不修饰碱基，其特异性强，切割位点固定，Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。。 [2]限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。本实验可加深对限制性内切核酸酶切割质粒 DNA 的位点特异性的认识，通过实践充分了解 EcoRV 和 Pvu II 两种酶双酶切质粒 DNA 产生的片段。没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展， 在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。限制性核酸内切酶均来源于原核生物，用于抗击外来 DNA 的入侵。限制性核酸内切酶， 能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异位点 上，并切割双链 DNA 的酶，是一类能识别双链 DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。因此研究限制性核酸内切酶对质粒 DNA 的切割具有重要的意义。 限制性核酸内切酶是一种可以识别 DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶[3]。约翰霍普金斯大学的丹尼尔·那森斯、汉弥尔顿·史密斯与伯克利加州大学的沃纳·亚伯因为限制性内切酶的发现与研究而获 1978 年度的诺贝尔生理学奖，开创了分子遗传学的新篇章[4]。目前，限制性内切酶的酶切技术因其操作简单和快速等优点广泛应用分子生物学等领域。双酶切更为广泛应用于载体构建等分子生物学实验，因为单酶切后连接目的基因理论上会出现 50%可能的错误性，而双酶切后的不同劲性末端在一定程度上避免单酶切的不足[5]。 分子生物学实验中，基因的重组与分离涉及到一系列的酶促反应。许多种酶在基因克隆实验中有着广泛的用途。多种细菌能合成限制性核酸酶，这是它们保护自己，降解外来 DNA 分子的重要手段。每一种内切酶能识别 DNA 分子中由 4～6 个核苷酸组成的特定序列。而细菌细胞内