应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析汇总.docxVIP

邢德峰等：应用DGGE 邢德峰等：应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析,/微生物学报(2006)46(2) PAGE # PAGE # PAGE # XING De-feng el al. I Acta Micrabiologica Sinica (2006 )46(2) 46卷 46卷2期 2006年4月4日 46(2): PAGE #-335 4 April 2006 微生物学报Acta Microbiologica Sinica 应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析 雌%任南K （哈尔滨工业大学市政环境工程学院哈尔滨150090） 摘 要：变性梯度凝胶电泳（DGGE）是通过核酸片段对微生物群落进行研究,可以监测未培养细菌及其功能基因， 被广泛地应用于微生物群落多样性和动态分析，并成为微生物分子生态学研究中的里要手段之一。文中论述r DGGE操作过程中遇到的常见问题.并提出了相应的解决方法。全面分析了样品预处理过程和PCR扩增效果对 DGGE分析的影响，探讨了 DGGE图谱的优化过程和图谱分析方法，并对DQGE的应用前景进行了综述。 关键词：DGGE；微生物辞落；微生物分子生态学；图谱分析；排序 中图分类号：Q938.I 文献标识码：A 文章编号:0001?6209 （ 2006 ） 02-0331-05 基金项目：国家 基金项目：国家“973项目XG2000G2G02）;国家自然科学基金;国家杰出青年科学基金（5012123） ?通讯作者。Td：86451 Fax：86^?51 E-mail； mq@. ixdf@ 作者荀介：邠萄修（1977-）,男，黑龙江人，博士研究生，研究方向为环境生物技术。E-maiJ；况 if@ 收槁日期：2005?ld25；接受日期：2005?123；修回日期：2005?12?13 变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）技术是由Fischer ft Lerman于1979年最先提出的用于 检测DNA突变的一种电泳技术⑷。1993年Muzyer等.首次 将DGGE技术应用于微生物生态学研究,并证实了这种技术 在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具 有明显的优越性。DGGE是通过核酸信息对微生物群落进 行表征,比传统的菌种分离培养技术更快捷，并可以鉴定出 未培养细菌”由于自然界中只有0.1% ~ 1%的微生物通过 常规方法能被培养加，所以与传统方法相比DGGE技术能够 快速、准确地鉴定在自然生境或人工生境中的微生物种群， 并进行史杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态、基 因定位、表达调控的评价分析。由于DGGE具有可靠性强、 重现性高、方便快捷等优点，短短的十年内，已经成为微生物 群落遗传多样性和动态分析的强有力工具，并被广泛用于活 性污泥、生物膜、土壤、底泥等环境样品中的微生物多样性检 测和种群演替的研究㈤。 DCGE技术检测核酸序列是通过不同序列的DNA片段 在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导 致电泳速度的急剧下降，最后在其相应的变性剂梯度位置停 滞，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。该技术可 以分辨具有相同大小片段的序列差异，可以用于检测单一破 基的变化.微生物群落遗传多样性以及PCR扩增DNA片段 的多态性。该技术主要操作过程如下:①样品预处理；②样 品DNA（或RNA）提取及纯化;③16s rDNA或基因片段的PCR （或RT?PCR）扩增;④预实验（DGGE条件优化）;⑤制胶;⑥样 品的DGCE分析;⑦图游分析;⑧条带序列分析。 应用DGGE分析微生物群落时，主要包括两个方面的内 容，一是获得高分粉率的图谱，另外就是对图谱信息进行合 理的生物学解释。近年来，许多研究人员在利用DGGE分析 微生物群落时，经常遇到一些类似的问题,我们根据DGGE 的操作过程，对一些常见问题进行了整理和分析，并提出了 相关的解决办法。 DGGE图谱的优化 利用DGGE分析复杂样品时，获裾高分辨率的图谱是重 要的前提条件。影响DGGE分辨率的因素很多。如DNA（或 RNA）提取效果、PCR（或RT.PCR）扩增效果、电泳时间、电泳 温度、凝胶浓度、变性剂梯度、柒色方法等。在DGGE的操作 过程的每一个环节都会对后续分析产生影响并导致误差的 产生，因此为了获得DGGE的最大分辨率,必须对全部环节 进行优化。 样品处理 细胞是否充分裂解，以及核酸降解等因素，那会影响 DNA或RNA的提取效果。生择适宜的核酸提取方法不仅可 以提高产率,更重要的是可以更准确的反应微生物的实际群 落构成状况,不同提取方法获得的D