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山茱萸多糖提取工艺试析论文 1器材和方法 1.1材料 供试山茱萸干燥果实产于安徽,购于广州中医药大学大药房有限公司中药饮片厂，将山茱萸原料粉碎,置干燥器中备用。 1.2试剂 浓硫酸，质量分数为6%的苯酚(分析纯重蒸馏试剂),质量分数为95%的乙醇,氯仿,正丁醇,葡萄糖,氯化钠等,以上试剂均为分析纯。 1.3仪器 核酸蛋白测定仪,德国Hettich公司；自动收样器,美国Whaters公司；AlphaI-2型真空冻干机,德国Christ公司；电热恒温水槽(DK8D型),上海森信实验仪器有限公司；高速冷冻离心机,德国Hettich公司。 1.4方法 1.4.1粗多糖样品的制备 山茱萸干粉,不同条件加热(搅拌)浸提,离心,上清液加热浓缩至体积的1/4,95%乙醇沉淀至75%(V/V)，4℃静置过夜,离心,取沉淀,丙酮乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗,真空冷冻干燥得到粗多糖样品。 1.4.2山茱萸多糖含量测定［4］ 采用苯酚-硫酸法,以葡萄糖为标准单糖制作标准曲线，得回归方程为：Y=0.0077X+0.0257,R2=0.9995［多糖的量（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标］。 准确称取粗多糖样品6mg,加蒸馏水至50ml,配成120μg/ml的样品溶液。吸取样品液1.0ml，按标准曲线同法操作，测光密度，以标准曲线计算总糖含量。 1.4.3得率的计算山茱萸多糖得率(%)=山茱萸粗多糖样品中总糖含量(g)/山茱萸原料质量(g)×100%。 1.4.4单因素分析及正交实验 本实验选取温度、时间、料液比、pH值这4个因素进行分析,并从中选取3个因素水平根据单因素分析结果,采用L9(34)表做正交实验,以多糖提取率作为衡量提取效率的客观指标，以确定最佳提取工艺。 1.4.5山茱萸多糖的分离纯化 按最佳提取工艺流程,将提取的红褐色山茱萸粗多糖(ZA)复溶于水,用Sevag［5］法除蛋白,重复3次,加95%乙醇至30%,离心,得到粗多糖(ZB),上清液继续加95%乙醇至60%,4℃静置过夜,丙酮-乙醚-无水乙醇溶剂系统反复冲洗,真空冷冻干燥,得到粗多糖样品(ZC)。称取样品AC200mg,溶于100ml蒸馏水中,然后加到DEAE-cellulose-52离子交换柱洗脱(2.6cm×26cm)上,依次用蒸馏水及0.1，0.3，0.5，0.8，1.0mol/L的NaCl水溶液洗脱,多功能电子蠕动泵控制流速为1ml/min,用自动收集仪收集,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,合并各吸收峰的洗脱液,蒸馏水透析3d，旋转蒸发仪浓缩,冷冻干燥,得到山茱萸多糖的两个分离产物S1和S2。 1.4.6纯度测定 凝胶色谱法:用0.05mol/LNaCl溶液充分溶胀葡聚糖凝胶SephadexG200,超声脱气,搅拌均匀,沿玻璃棒小心缓慢地加入到柱中,同时用洗耳球敲击柱壁,使填料沉降均匀、紧密。柱型(2.6cm×33cm)，装柱完成后,用0.05mol/L的NaCl溶液平衡48h。称取经DEAE柱分离得到的多糖样品20mg,溶于0.05mol/L的NaCl溶液中,加入到SephadexG-200凝胶柱中,洗脱液控制流速为0.1ml/min,用自动收集仪收集洗脱组分,2ml/管,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,观察吸收峰形状,若峰对称,说明样品较纯,若峰形不对称,说明样品不纯,需要进一步分离纯化,方法同上。 1.5山茱萸多糖理化性质 1.5.1物理性质 山茱萸多糖的颜色、形状、水溶性、有机溶剂的溶解性等。 1.5.2化学性质［6］ Molish反应,硫酸-苯酚反应,Fehling试剂反应,碘-碘化钾反应，三氯化铁反应。 1.5.3蛋白含量测定考马斯亮蓝法:以牛血清白蛋白制备标准蛋白质溶液，以OD595值为纵坐标,蛋白的量为横坐标做标准曲线：Y=0.0039X+0.0032，R2=0.9993。 1.5.4多糖基本元素分析 通过CHNS/O元素分析仪来确定纯化后山茱萸多糖中基本元素的组成。 2结果 2.1山茱萸多糖提取条件的单因素分析 2.1.1乙醇添加量山茱萸多糖得率随乙醇添加量增加而增加,乙醇添加倍数达到3倍时，多糖沉淀完全,所以本研究以下的实验均选用3倍体积乙醇沉淀多糖。见图1。 2.1.2提取温度温度是影响多糖得率的重要因素。不同温度(40，50，60，70，80，90℃)对多糖得率产生影响:多糖得率随温度升高而升高,40～60℃升高较慢60～80℃较快,80