恒温扩增技术的原理与用途探究.docVIP

恒温扩增技术的原理与用途探究 即通过对靶序列的特异性扩增，使其产生大量拷贝，以达到检测水平。主要包括以下技术。环介导等温扩增技术，又称为环媒恒温扩增技术或连环恒温扩增技术，是由Notomi等于2000年所开发的一种核酸扩增技术[7]。LAMP的核心是具有链置换活性的Bst（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶的应用以及基于靶核酸6个特异性片段（即5’端的F1、F2和F3区和3’端的B3c、B2c和B1c区，其中F2区和B2区为目的扩增片段）的4条特殊引物的设计，分别为上游内部引物（FIP，由F1c区和F2区组成）、下游内部引物（BIP，由B1c区和B2区组成）、上游外部引物（F3，由F3区组成）及下游外部引物（B3，由B3组成）。整个扩增过程分为起始阶段和循环扩增阶段。⑴起始阶段：FIP的F2序列首先和模板F2c结合，引导合成互补链；随后，F3与模板F3c结合，在BstDNA聚合酶的作用下启动链置换合成并释放出结合有FIP的完整互补链。此单链5’端F1c和F1自我碱基配对形成环状结构。以此链为模版，引物BIP和B3以相同的方式引导另一端链合成、链替换，从而形成哑铃状结构的单链。F1c末端可自发引导补齐中间单链缺口,使哑铃状单链转化为双链茎环结构。此产物可作为下一阶段的起始物为LAMP基因的扩增循环提供模板。⑵循环扩增阶段：引物FIP与茎环结构结合,以双链中一条链为模板延伸,并释放出另一条链,；释出链游离3c端自身成环,引发链延伸取代并释放FIP引导合成的链,两产物均可作为下一循环的起始物。引物BIP和FIP与上述产物的茎环结合重复以上延伸过程,使产物延长同时释放新的链成环并作为新的起始物。其最终产物为一系列长度不同的茎环状双链DNA片段。LAMP灵敏度高、特异性好，且操作简便、快速，结果易于判定，这些优点使得该技术自成立十余年以来在病毒、细菌、寄生虫等各类病原体的基因检测上得到了广泛应用。如：Suzuki、Iwata、Ihira等分别建立了巨细胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）、人类疱疹病毒6型（HSV6）的LAMP检测方法[8-10]；Iwanoto、Hara-Kudo、Seki等分别针对肺结核分支杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌建立了LAMP检测体系，并对其灵敏度和特异性进行了评价[11-13]；而Lin、Han等分别以弓形虫病、四种疟原虫疾病为研究对象，比较了LAMP与real-timePCR、nestedPCR的检测效能，证明LAMP技术可以作为流行区现场快速而简便的疾病筛选工具[14,15]。但因建立时间较短，LAMP仍存在一些不足，其中最大的缺点就是容易出现假阳性。由于LAMP采用了多条引物，而且是在同一温度条件下扩增，引物之间有可能互补而扩增出现非特异性条带。此外，产物鉴定只针对有或无，缺乏一定的特异性。 1989年首先报道的以转录为基础的和核酸扩增技术[16]。该技术从互补的靶核酸（一般为RNA）合成DNA分子开始，以新合成的cDNA为模版进行转录。反应体系主要涉及三种酶活性（T7RNA聚合酶、核糖核酸酶和逆转录酶）和两条特异引物。整个反应过程可分为非循环相和循环相。在非循环相中，以单链RNA为模板，先后在逆转录酶、核糖核酸酶和DNA聚合酶的催化作用下，生成带有T7RNA启动子的双链DNA（cDNA）；此双链DNA在T7RNA聚合酶的催化下合成大量互补于靶序列的反义RNA，由此进入循环相。循环相中，以反义RNA为模板，经重复循环的进行cDNA合成、RNA降解、T7RNA聚合酶催化转录，使目的RNA不断得以扩增。TAS主要包括两种反应体系，即依赖核酸序列的扩增（nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA）和转录介导的扩增（transcriptionmediatedamplification,TMA）。前者又称为自主序列复制系统（self-sustainedsequencereplication,3SR），于1990年由Guatelli等首先报道[17]；1991年，Compton对此进行了详细描述[18]。该反应体系所涉及的三种酶为：AMVRT（鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶）、RNaseH和T7RNA聚合酶。反映在42℃条件下，1.5h内即可将RNA模版扩增至109~1012倍。相对于NASBA的三酶体系，TMA使用的是二酶体系，即MMRT（money鼠白血病病毒逆转录酶）和R7RNA聚合酶。MMRT兼具有逆转录酶和RNaseH的活性，因此可省略RNaseH，从而降低反映成本，且使体系更稳定。近年来，TMA与实时荧光检测技术相结合，出现了实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT），以直观反映扩增循环情况。TAS非常适用于单