最新几种pcr扩增的比较资料.pdfVIP

精品文档 普通PCR、原位PCR、反向PCR 和反转录PCR 的基本原理和操作步骤 普通PCR 1 概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术， 用于放大特定的DNA 片段。可看作生物体外的特殊DNA 复制。DNA 聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955 年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70 年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温， 高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶 (简称Taq polymerase), 则是于1976 年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus ）分 离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于 80 年代之后。PCR 最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971 年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR 前两个 周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR 则于1983 由 Dr. Kary B. Mullis 发 展出的，Dr. Mullis 当年服务于PE 公司，因此PE 公司在PCR 界有着特殊的地位。 Dr. Mullis 并于 1985 年与 Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项 背。随后PCR 技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究 的最重要技术。Mullis 也因此获得了1993 年诺贝尔化学奖。 2 PCR 原理 PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板 DNA 的变性：模板DNA 经加热至 93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反 应作准备；②模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后， 温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸： DNA 模板-- 引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNT （脱氧核糖核苷三磷 酸）为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条 新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可 获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成 一个循环需2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 3. PCR 反应体系与反应条件 3.1 标准的PCR 反应体系 10 ×扩增缓冲液 10μ l 4 种dNT 混合物 200μ l 引物 10～100μ l 模板DNA 0.1～2μ g Taq DNA 聚合酶 2.5 μ l 2+ Mg 1.5mmol/L 精品文档 精品文档 加双或三蒸水 100 μ 3.2 PCR 反应五要素 参加PCR 反应的物质主要有五种即引物(PCR 引物为DNA 片段，细胞内DNA 复制 的引物为一段RNA 链)、酶、dNTP 、模板和缓冲液 （其中需要Mg2+)。 ［PCR 步骤］标准的PCR 过程分为三步： 1.DNA 变性 （90 ℃-96 ℃）：双链DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65 ℃）：系统温度降低，引物与DNA 模板结合，形成局部双链。 3.延伸（70℃-75 ℃）：在Taq 酶（在 72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP 为原料，从引物的5 ′端→3 ′端延伸，合成与模板互补的DNA 链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA 含量即增加一倍。现在有些 PCR 因为扩 增区很短，即使Taq 酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改 为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65 ℃间进行，以减少一次升降温过程，提 高了反应速度。 4 PCR 反应特点 4.1 特异性强 PCR 反应的特异性决定因素为： ②底物与模板DNA 特异正确的结合； ②碱基配对