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医学免疫学实验指导：补体参与的反应 内容： 实验十二、补体结合试验 实验十三、总补体活性测定 补体（complement）是存在于正常人和脊椎动物血清及组织液中一组具有酶原活性的蛋白质。当它们被某些物质激活后，即可发生连锁的酶促反应，表现出各种生物学活性。 利用补体激活后的各种生物学功能（如溶细胞及免疫粘附等），可进行有关实验，涉及补体的实验方法大致分为两类：一类是有补体参与，用已知抗体（或抗原）检测相应抗原（或抗体）的实验。另一类是直接对补体活性和各组分含量的检测。下面主要介绍补体结合试验及血清总补体活性测定。 实验 、补体结合试验 （Complement fixation test，CFT） 补体结合试验是利用抗原抗体复合物可与补体结合，而单独的抗原或抗体不能结合补体的特点，以溶血系统为指示剂，用已知抗原（或抗体）来检测未知抗体（或抗原）。此试验中有5个成分参与，分属于2个系统： 第一系统为反应系统：抗原+抗体+补体。如果抗原与抗体相对应，则能特异性结合并固定补体；否则，补体不被结合，仍游离于溶液中。 第二系统为指示系统：绵羊红细胞+溶血素。作为第一系统抗原与抗体是否对应的指示剂，如第一系统中抗原与抗体特异性结合，固定了补体，则再加入羊红细胞与溶血素时，由于缺乏补体，不会发生溶血反应，此为CFT阳性。若抗原抗体不对应，则补体不被结合，仍游离于溶液中，而被随后加入的羊红细胞与溶血素复合物固定，并被激活，导致红细胞溶解，此为CFT阴性（如图 ）。 图 补体结合实验示意图 本试验敏感性和特异性均较高，可用于检测某些病毒病、立克次体病、梅毒病等。 【材料】 ⒈ PH7.4巴比妥缓冲液。 ⒉ 补体：豚鼠新鲜血清2u单位。 ⒊ 绵羊红细胞：用缓冲液洗涤3次，配成2%悬液。 ⒋ 抗原（2u）：可购商品，按说明稀释至使用效价。如自制，则需用阳性抗血清滴定其效价。 ⒌ 待检血清和阳性血清：56℃灭活30min，1：50稀释。 ⒍ 溶血素（2u）。 ⒎ 生理盐水、小试管、刻度吸管、恒温水浴箱。 【方法】 ⒈ 取试管5支，标明顺序（表 ）。 ⒉ 按表 依次加入病人血清、抗原、补体、生理盐水摇匀。 ⒊ 放37℃水浴箱中30min。 ⒋ 取出加入溶血素和羊红细胞，摇匀。 ⒌ 再放入37℃水浴箱中水浴30min，取出观察结果。 表 补体结合试验（单位：ml） 【结果】 ⒈ 管内液体混浊呈浅红色为不溶血。 ⒉ 管内液体透明呈红色为溶血。 ⒊ 第2、3、4管为对照管均应溶血，第5管为羊血细胞对照不应溶血。凡第1管红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性，而不溶血者为阳性。 【注意事项】 ⒈ 为了防止产生抗补体，要求血清和其他液体标本，以及所用的诊断抗原、抗体，均不能被细菌污染。血标本应立即分离血清，及时操作或冰冻保存。 ⒉ 除补体外，各种血清均需56℃，30min灭活。 ⒊ 所有的试管、吸管等玻璃仪器必须十分洁净。 ⒋ 由于试验中各成分量之间必须有适当比例，才能避免结果的假阳性或假阴性，因此除绵羊红细胞浓度固定外，其他成分如溶血素、补体、抗原或抗体均需事先滴定其单位，配制成规定浓度，以保证结果的可靠性。 附： ⒈ 溶血素单位滴定： 先用缓冲液将溶血素稀释成不同浓度，再将不同浓度溶血素按表 滴定后取出观察，以出现100%溶血的最高溶血素稀释度为1U。如表 结果所示，1：4000的溶血素（0.1ml）为1U，正式试验用2U，即1：2000的溶血素（0.1ml）。 表 溶血素滴定 ⒉ 补体单位滴定： 按表 操作后取出观察，以出现100%溶血的最小补体量为1U。如表3所示，1：30的补体0.12ml为1U，2U则为1：30补体0.24ml。正式试验要求补体0.2ml中含2U，其计算方法如下：0.24：0.20=30：X；X=（0.20/0.24）×30=25。故将补体原液1：25稀释后，每0.2ml即含有2个U。 ⒊ 抗原滴定： 将抗原和阳性抗血清分别用缓冲液作倍比稀释，使成为1：2、1：4……1:256。 按表3所列抗原抗体的稀释度，每管加入抗原0.1ml、抗体0.1ml，对照管只加一种，用缓冲液替代另一种。 每管加入2U补体0.2ml，混匀，置37℃水浴60min，或置4℃冰箱过夜。 每管加入2%绵羊红细胞0.1ml及2U溶血素0.1ml，混匀，37℃水浴30min。 取出观察，以出现100%不溶血的抗原与抗体的最适稀释度作为抗原的最适浓度。如表4所示，1：64抗原管及1：32抗血清管各作为1U。正式试验时，抗原采用2-4U（1：16-1：32），抗体采用4U（1：8）。 表 补体滴定 表 抗原抗体滴定结果示例 实验 、总补体活性测定（CH50单位测定） （To