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医学免疫学实验指导：免疫标记技术 内容： 实验 、免疫荧光技术 实验 、流式细胞术 实验 、酶联免疫吸附实验 实验 、放射免疫测定法 免疫标记技术（immunolabelling techniques）是指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为示踪物，标记抗体或抗原，然后进行抗原抗体反应；并籍助于显微镜、射线测量仪、酶标测量仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定的一项免疫学实验技术。由于被标记的抗原或抗体仍具有与相应的抗体或抗原结合的特性，同时又具有了标记物的高敏感性，故免疫标记技术具有特异、敏感、快速、能定性、定量、定位，且易于观察等优点。 实验 、 免疫荧光技术 （Immunofluorescence technique） 免疫荧光技术又称荧光抗体技术。始创于40年代初，它是把免疫学的特异性与荧光素显示的敏感性同显微镜的精确性有机地结合起来的一项检测技术。 荧光素是一种染料，在紫外线或蓝光照射下，被激发出波长较长的荧光。某些荧光素在一定条件下，可与抗体分子结合，但不影响抗体与抗原结合的性能。用该荧光抗体将标本染色后，在荧光显微镜下加以观察，可对待检标本中相应抗原进行鉴定和定位。目前最常用的有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocynate，FITC），罗丹明（lissasmine rhodamine B200，RB200）等。其中FITC使用最广泛，它的最大吸收光谱为490-495nm，最大发射光谱为520-530nm，呈黄绿色荧光。 用于临床检验的荧光抗体试验主要有直接法、间接法、补体结合法。 1． 直接免疫荧光法：是将荧光素标记在针对某抗原的特异性抗体上，直接检测该抗原。此法操作简单，可用于检测细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白抗原。其缺点是只能检查一种相应抗原，实际工作中很不方便故很少应用。 图 直接免疫荧光法 ⒉ 间接免疫荧光法：是将荧光素标记在第二抗体上，然后与抗原抗体复合物反应。可用于检测未知抗原，也可用于检测未知抗体。此法只需制备一种荧光抗体就可以检出多种抗原，可用于不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的检测，以及自身抗体和感染病人血清抗体的检测。间接法比直接法敏感性高，但较易产生非特异性染色。 图 间接免疫荧光法 ⒊ 补体结合法：是将荧光素标记在抗补体抗体上，然后与抗原-抗体-补体复合物反应。可用于检测未知抗原或抗体。此法荧光抗体不受免疫血清动物种属的限制，一种荧光抗体可作更广泛应用。对检查形态小的如立克次体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质甚为理想。补体结合法敏感性更高，但更易产生非特异性染色。 图 补体结合法 下面以抗核抗体（antinuclear antibody，ANA），即真核细胞核成分为靶抗原的自身抗体检测为例，着重介绍间接免疫荧光法（该抗原和抗体无器官及种属特异性）。 【材料】 ⒈ 大白鼠。 ⒉ 兔抗人免疫球蛋白荧光抗体（商品化试剂）。 ⒊ 正常人血清、SLE阳性血清、待检血清。 ⒋ 0.01mol/L，PH7.0磷酸盐缓冲盐水（PBS）。 ⒌ 恒温孵箱、载玻片、有盖湿盒、烧杯、荧光显微镜。 ⒍ 缓冲甘油（1份甘油，1份PBS）。 【方法】 ⒈ 制备抗原片：将大白鼠断颈，放血，剖腹取肝脏，并将肝脏剪成8mm×5mm的组织块，用吸水纸吸干渗出的浆液后，压印于洁净的载玻片上，使留下一薄层肝组织细胞。将肝组织印片凉干后置4℃冰箱冷藏1周备用。 ⒉ 取肝印片，编号，分别滴加正常血清、SLE阳性血清、待检血清、PBS后置湿盒，37℃孵育30min。 ⒊ 用PBS冲洗2-3次，冷风吹干。 ⒋ 滴加荧光抗体，置湿盒37℃孵育30min。 ⒌ 用PBS冲洗2-3次，冷风吹干，滴加缓冲甘油1滴，覆以盖片后，在荧光显微镜下观察。 【结果】 先置低倍镜观察，阳性者，可见有大小一致边界清楚的绿色荧光。可疑者再以高倍镜进一步观察。 【注意事项】 ⒈ 温育时一定要将玻片放在湿盒中，以防液体蒸发。 ⒉ 注意与非特异性荧光鉴别，后者往往较大，形态不一，边界不清。 ⒊ 每次试验还应设PBS对照（鼠肝印片+PBS），以排除非特异性荧光。 附：0.01mol/L PBS(PH7.0)： A液（0.2mol/L）：NaH2PO4·H2O 27.6g，加蒸馏水至1000ml B液（0.2mol/L）：Na2HPO4·12H2O 71.6g，加蒸馏水至1000ml A液16.5ml，B液33.5ml，NaCl 8.5g，加蒸馏水至1000ml。 实验 、流式细胞术 （Flow cytometry，FCM） 流式细胞术是一种通过流式细胞仪—又称荧光激活细胞分离器（fluorescene activated cell