时间分辨荧光分析法副本.pptx

时间分辨荧光分析法及其应用目录一、时间分辨荧光分析法的基本概念二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点三、时间分辨荧光分析技术简介四、时间分辨荧光分析法的应用五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测 方面的应用六、展望一、基本概念： 1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出波长相同或比吸收波长更长和的光，这种现象称为光致发光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。 2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射出的光称为荧光(fluorescence)。 3.根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法称为荧光分析法(fluorometry)。 5.时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA）是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19g/ml，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点1.原理 TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。时间分辨荧光免疫原理图2.优点 TRFIA 技术具有酶标记分析技术和同位素标记技术的优点: 具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围宽，试剂寿命长，操作简便和非放射性等特点： 镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes 位移能够达到 200 nm 以上，很容易分辨激发光和发射光，从而激发光干扰就可以排除。 镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间要长的多，为传统荧光的 103～106倍。 镧系离子与双功能螯合剂螯合后，可形成稳定的螯合物，稳定性非常高，生产出的产品保质期可以长达 2 年。三、时间分辨荧光分析技术简介TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双功能螯合剂、分析缓冲液、增强溶液。基本技术包括包被技术、标记技术、反应模式。1.基础试剂：1.1示踪剂的选择 　 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中的 ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、钇(yttrium , Y)和镧系元素。到目前为止,只有铕(europium , Eu)、铽(terbium ,Tb)、钐(samarium ,Sm)、钕 (neodymium ,Nd)、镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示踪剂,尤以 Eu3 +常用。 示踪剂的使用 一般用Eu2O3制备成EuCl3,再经纯化和 常温真空抽干,然后干燥保存。1.2 稀有元素双功能螯合剂 稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗体结合,因此在标记时需要有一种双功能基团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、酪氨酸) 连接。1.3 增强溶液 免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱,这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所产生荧光的淬灭剂。所以要加入一种增强液。增强液一般由β-二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、TritonX-100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2.0 ~3.2)组成。2.基本技术：2.1 包被技术 TRFIA包被技术,是保持其灵敏度重要因素,因此在包被抗体之前,往往要对抗体进行纯化,以提高抗体的包被量和均一性。国内外最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的碳酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH为4.5 ,效果明显优于碳酸盐缓冲系统。2.2 标记技术 抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标记物标记到抗原或抗体上。标记时不同蛋白质的反应性依赖于蛋白表面的游离氨基酸数目和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨基酸数目越大,蛋白质的特异等电点越高,蛋白质易与螯合剂反应,从而产生较高的标记率,但其标记比率与免疫反应不成正比关系。镧系离子Eu3 +可用来标记核酸探针。2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相抗体竞争法。2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完全解离下来,