基因操作原理05.pptxVIP

会计学;PCR， polymerase chain reaction 是80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的其它领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。;一、PCR principle 1．基本要素 PCR是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地扩增DNA某个特殊区域的技术 ·template：ssDNA or dsDNA ·primers：oligo-nucleotides 等 ·substrates: dNTP ·DNA polymerase: Taq poly;? 基本原理：即DNA合成的基本原理 template/primer/DNA poly ? 使用的推广来自高温DNA poly;DNA amplification ;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;DNA amplification;第45页/共190页;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;——;——;——;——;——;——;——;——;;;;;;;——;——;——;——;——;——;——;——;——;——;——;——;——;——;第111页/共190页;denature;二、PCR反应体系 1．缓冲液 buffer (1×) 50Mm KCl 引物退火 annealing 10mM Tris·HCl pH 8.3-9.0 1.5mM MgCl2 (0.5-2.5) 特异性和产率(-20℃保效，Mg2+不含沉淀析出) 0.01% 明胶 (0.1 Triton-100);2. dNTP 终浓度0.2mM (即饱和浓度) （pH7.0） ·4种dNTP 应平衡，提高忠实性 ·使用时应考滤Mg2+, 引物，产量之间的关系 如序列分析和制备探针时，用20-40?m ;3.引物 primers 各1?m,即1pmol/?l OD260 dsDNA 50?g/ml(molecular cloning) ssDNA 40?g/ml oligo 33?g/ml 引物设计原理 ① 长度至少16bp,通常20-30bp ② Tm=81.5+16.61og[J+]+0.41(G+C)%-(675/N) N:链长 J：单价离子浓度 若N=20 G+C%=55% [J+]=60mmol/L 则 Tm=81.5-20.3+22.6-33.75=50.05;简单计算 Tm=(G+C)×4+(A+T)×2 对于较短引物 ;③ 避免二级结构的形成 二聚体 二级结构 ④ G/C和A/T分布尽量均匀,一般G+C%45-55% oligo dT /oligo dC 除外， ⑤ 其它，如5’末端，限制酶位点的长度 ⑥ 随机引物 6nt 10-12nt;4. 模板 template ?g or ng